蛋白分析FAQ汇总

• • 非变性蛋白，未煮，未变性，加loading后可以直接冻存吗？可以加一点ME吗？

  是的，未变性蛋白样品在加loading buffer（上样缓冲液）后是可以直接冻存的，但需要注意以下几点： 可以直接冻存的条件： （1）上样缓冲液（Loading Buffer）不含SDS或变性剂 如果你使用的是非还原性、非变性条件的上样缓冲液（如没有SDS、没有DTT/β-ME、没有加热

• • 请问如何确定蛋白质的分子量，因为预测二级结构好像有这些数据？

  您提到“预测二级结构可能使用蛋白质的分子量信息“，这种说法可能存在误解。蛋白质分子量主要用于分离与鉴定，与二级结构预测并无直接依赖关系。

• • 请问肠组织不加loading buffer直接放-80可以保存多久?

  未经处理的肠组织置于-80℃冷冻保存建议时间不超过1个月，且不适用于高质量蛋白或RNA分析。 若对后续数据质量有要求，建议尽快按实验方向分组处理或加保护剂冷冻。

• • 请问wb提取后的蛋白放在负八十后，重新加loading的话还需要再次测量蛋白浓度吗？

  若蛋白冻存前未加上样缓冲液并未变性处理，则重新加loading前应重新测定蛋白浓度以确保上样准确性和重复性；若已加缓冲液并变性，可直接使用，但仍需控制冻融次数，防止蛋白降解。

• • 如果想测定蛋白NC端，样品的条件是怎样的？

  蛋白N端测定的样品准备对实验结果至关重要，具体条件需根据所采用的方法（如Edman降解、质谱法）略作调整。蛋白C端测定的实验挑战性相对更高，因其缺乏类似Edman降解的经典方法，主要依赖质谱法结合特异性策略实现。

• • 蛋白裂解后未测浓度直接冻存，分装会降解吗？

  为避免蛋白因冻融循环造成的降解风险，建议将当前样品在低温下一次性解冻后立即分装，测浓度和后续使用的部分应分别处理，避免回冻。同时，应尽可能补加蛋白酶抑制剂以减缓降解。未来实验中应在裂解后当日完成蛋白定量与分装，确保冻存样品仅经历一次冻融过程，从源头保障蛋白样本的稳定性与实验结果的可靠性。

• • 细胞之间的交互，备样的时候是重组蛋白在铺板以后加入培养基刺激b细胞，还是提取b细胞的膜蛋白再和重组蛋白孵育，再进行纯化呢？

  针对分泌蛋白与b细胞受体的筛选，建议采用体外孵育重组蛋白与b细胞膜蛋白、随后通过亲和纯化结合复合物并进行质谱鉴定的策略以确保结合特异性、降低背景干扰并提高受体识别的成功率。相比刺激活细胞后裂解的方式，该方法更适合用于受体初筛。后续可结合功能验证手段对候选受体进一步确认。

• • 100V60min用的是0.22μM的PVDF膜，一抗孵育是4°12-16h，这些条件可以用在孵育dsHMGB1上的吗?

  你的转膜和抗体孵育条件看起来是比较常见的Western Blot（WB）条件，但针对 dsHMGB1（二硫键高迁移率族蛋白 B1，disulfide HMGB1），需要考虑以下几个关键因素以确保蛋白转移和检测的成功率。

• • 样品未加够缓冲液直接冷冻，还能补加再煮用吗？

  上样缓冲液的不足可能会对样品的完整性和实验结果的可靠性产生一定的影响。我们需要逐步分析这个问题以决定该样品是否还能用，以及如何处理它。

• • 已知蛋白质名称是“重组人IL-2蛋白（高效型）“，蛋白序列代号是“IL2 (P60568-1) ......

  已知蛋白质名称是“重组人IL-2蛋白（高效型）“，蛋白序列代号是“IL2 (P60568-1) (Ala 21-Thr 153)”如何查找其序列和相关文献？要查找重组人IL-2蛋白的氨基酸序列和相关文献，可以按照以下步骤进行：