二硫键定位分析

二硫键是蛋白质中的一个重要结构单元，它是由两个半胱氨酸氨基酸残基中的硫原子在氧化环境下形成的，对于生物活性和功能起着决定性作用。二硫键广泛存在于细胞表面受体、抗体、生长因子、激素、酶等蛋白质中，并且容易被还原或发生错误配对，导致原始多肽或蛋白质的结构和生物学活性受到影响。二硫键定位分析通过确定蛋白质结构中二硫键位置和连接方式可以深入了解蛋白质的结构和功能。在生物药物的制备和研发过程中，错误的二硫键配对可能会导致药物失效，甚至可能有潜在的安全风险，因此，对二硫键进行准确的检测和控制是生物制品表征中必不可少的。

图1 二硫键定位分析原理

液相色谱质谱联用（LC-MS）技术的发展极大提高了检测的灵敏度和准确性，推动了二硫键分析的发展，也在二硫键定位分析中发挥着不可替代的作用。百泰派克生物科技BTP通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证。公司根据二硫键分析原理，结合高效液相色谱仪与高分辨率质谱仪建立了二硫键分析平台，为您提供精准的二硫键定位分析服务，无论链内/链间二硫键、一对/多对二硫键、交叉重叠抑或是错配的二硫键，BTP都可进行高效准确的鉴定。欢迎免费咨询，了解更多详情！

实验仪器

高效液相色谱仪：Easy-nLC 1200 （Thermo Fisher Scientific）
高分辨质谱仪：Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer（Thermo Fisher Scientific）

案例示意

液相色谱质谱联用法定位二硫键，不进行还原处理，而是直接进行烷基化，这个步骤将游离的巯基封闭。随后，进行酶切操作，将蛋白质分子切割成小片段。在这个过程中，存在二硫键的半胱氨酸之间形成了特定的连接，导致分子量发生变化。接下来，通过质谱仪采集数据，并使用相应的分析软件进行数据库匹配，从而得到二硫键的信息。

表1 二硫键分析

Site：形成二硫键的半胱氨酸在蛋白中的位置；Enzyme：酶解蛋白所用的酶；Peptide：肽段序列；Peptide_Mass：肽段分子量；Mass_Error(ppm)：肽段的质量偏差

图2 肽段二级图

常见问题

问题1：质谱法鉴定二硫键的优势是什么？

回答：质谱法在鉴定二硫键方面具有多个优势。首先，它不仅可以确定二硫键的存在与数量，还能确定二硫键的具体位置和相对含量，提供了更详细的信息。其次，质谱法具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以准确地检测和定量二硫键，即使在低浓度下也能获得可靠的结果。此外，质谱法所需的样品消耗量相对较少，对于宝贵或有限的样品而言具有重要意义。因此，质谱法在二硫键分析中被广泛应用，为研究蛋白质结构和功能提供了有力的支持。

问题2：为什么要进行烷基化？

回答：进行烷基化是为了封闭游离巯基，防止实验过程中二硫键发生错配。在质谱分析中，样品的制备过程需要进行特殊处理，其中包括烷基化步骤。烷基化是通过将烷基化试剂与巯基反应，使巯基被烷基取代，形成烷基硫醇。这样可以有效地阻止巯基之间的反应，避免在实验过程中形成不正常的二硫键连接或错配。通过烷基化处理，可以确保在质谱分析中得到准确而可靠的二硫键信息，有助于揭示蛋白质的结构和功能特征。

中/英文项目报告

在技术报告中，百泰派克会为您提供详细的中英文双语版技术报告，报告包括：

1. 实验步骤（中英文）
2. 相关的质谱参数（中英文）
3. 二硫键定位分析详细信息
4. 质谱图片
5. 原始数据