小分子药物靶点鉴定及验证

现代药物发现和开发过程中，药物靶点和作用方式仍然是最大的两个挑战。正确的药物作用靶点不仅关系到药物的效力和特异性，还涉及到药物安全性和潜在的副作用问题。药物靶点是指药物与机体内生物大分子的直接结合部位，主要包括受体、酶、离子通道、转运体、核酸等生物大分子。鉴定药物作用的靶点对于新药的设计极为关键，它可以帮助我们理解药物的作用机理，建立药物活性与生物学功能之间的联系，预测可能的副作用和耐药机制，以及发现新的治疗靶点。通过靶点鉴定，可以确保药物研发过程的高效性和药物上市后的安全性。

新的药物作用靶点是一系列新药发现的突破口，寻找药物作用的新靶点已成为当今创新药研发激烈竞争的焦点。从药物开发角度来看，药物的效果很大程度上取决于它的作用靶点。目前主要使用两种药物发现策略：基于表型的药物发现和基于靶标的药物发现。基于表型的药物发现根据现有的药理学，在细胞、组织或器官中筛选小分子或多肽。基于靶标的药物发现首先涉及确定靶标，然后识别活性分子。随着分子生物学的快速发展，基于靶标的药物发现范式取代了传统的基于表型的方法，因为它可以提高筛选能力并定义合理的药物发现方案。

酶作为药物靶点

百泰派克生物科技（BTP）依托高分辨质谱平台，结合亲和层析技术以及活性位点定向探针技术，开发并验证了多种基于靶标的小分子药物靶点鉴定平台，为您提供分子间相互作用鉴定全流程科研服务，包括蛋白-蛋白互作（PPI）、蛋白-小分子药物互作，可以准确地识别和验证小分子药物的作用靶点，助力创新药物的发现和开发。百泰派克生物科技基于靶标的小分子药物靶点鉴定方案包括：

1.基于ABPP策略的小分子药物靶点鉴定及验证

基于活性的蛋白质分析（Activity-based protein profiling，ABPP）将基于活性的探针和蛋白质组学技术结合在一起，用于识别小分子的蛋白质靶标，甚至靶蛋白的活性位点。ABPP 利用由两个元素组成的活性位点定向化学探针：1）活性位点定向反应基团，用于结合和共价标记催化相关酶的特定子集（或家族），以及 2）报告标签（例如，荧光团、生物素、炔烃或叠氮化物）用于检测/定量和/或富集/鉴定标记的酶。原则上，小分子的活性基团直接与目标蛋白和报告基团相互作用，以利于目标捕获。根据所选的报告组，可以进行不同的后续实验。例如，荧光基团可用于快速凝胶筛选和鉴定细胞或动物中小分子的定位，生物素可用于蛋白质富集，然后通过质谱检测来鉴定目标蛋白质。

Front Pharmacol. 2018 Apr 9;9:353.

基于活性的蛋白质分析工作流程

服务内容

技术优势

1）特异性：通过特定活性探针针对性地标记活跃的酶类，高度特异的识别活性蛋白质；

2）功能性分析：能够直接评估蛋白质的酶活性状态，而不仅是其表达量或结构变化；

3）实时监测：可以在细胞内的生理条件下监测酶的活性，捕捉药物的即时影响；

4）非侵入性标记：探针与蛋白质的共价结合是非侵入性的，不会干扰其正常功能，保持了生物样品的生理真实性；

5）样品适用性：ABPP技术可用于细胞裂解物、活细胞、动物裂解物，甚至活体动物。

2.基于TPP策略的小分子药物靶点鉴定

热蛋白质组分析（thermal proteome profiling，TPP ）旨在全面了解小分子化合物与蛋白质的相互作用。其核心原理是基于一个事实：受热时的蛋白质会变性并变得不溶。蛋白质可以在与小分子（例如药物或代谢物）、核酸或其他蛋白质相互作用或翻译后修饰时改变其热稳定性。TPP使用基于多重定量质谱的蛋白质组学来监测数千种表达蛋白质的熔解曲线。重要的是，这种方法可以在体外、原位或体内进行。TPP已成功应用于识别药物的靶标和脱靶、研究蛋白质-代谢物和蛋白质-蛋白质相互作用、识别代谢物结合蛋白以及绘制与不同核苷酸相互作用的蛋白质图谱。

Nat Prod Rep. 2016; 33(5):719-730.

基于TPP策略的小分子药物靶点鉴定工作流程

服务内容

技术优势

1）全局性和非偏倚性：可以在全蛋白组水平上，无偏倚地探索小分子与蛋白质的相互作用；

2）细胞内作用分析：可在细胞的生理环境中捕捉真实的药物-蛋白质相互作用，反映药物的实际作用；

3）定量性：可提供关于药物-靶标相互作用强度和稳定性的定量信息；

4）数据可靠性：TPP可以同时在多个温度点上进行，因此可以减少因实验设置导致的偏差，提高数据的可重复性和可靠性。

3.基于LiP-MS策略的小分子药物靶点鉴定

限制性酶解-质谱分析（Limited Proteolysis-Mass Spectrometry，LiP-MS）结合蛋白质限制性酶解和质谱分析的技术，利用特定条件下蛋白酶对蛋白质进行有限度的切割生成的蛋白片段进一步通过质谱分析鉴定。在小分子药物靶点鉴定过程中，将小分子药物与其潜在的蛋白质靶点进行孵育，药物分子与蛋白质结合后会引起蛋白质构象的改变，这种改变会影响到蛋白质的酶解模式。通过比较药物处理和未处理条件下蛋白质的酶解片段，可以识别出与药物相互作用的蛋白质区域，进而推断出药物的作用靶点。这对于药物机制的解析和新药发现具有极其重要的意义，尤其是在有针对性地设计药物分子和优化药物效能方面。

Piazza, et al. 2018, Cell 172, 358-372.

基于LiP-MS策略的小分子药物靶点鉴定工作流程

服务内容

技术优势

1）高通量和高灵敏度：LiP-MS能够分析数千个蛋白质样本，即使是那些低丰度的蛋白质靶标也能被鉴定出来；

2）无需先验知识：这种方法不需要关于潜在靶点的预先信息，可以在广泛的蛋白质中发现未知的药物作用点；

3）体外和体内适用性：LiP-MS既可以在体外进行，也可以在体内应用，可提供更多关于药物如何与靶标相互作用的信息；

4）结构动态性分析：LiP-MS可以提供小分子与蛋白质结合后蛋白质结构变化的动态过程。

4.基于DARTS策略的小分子药物靶点鉴定

药物亲和致靶点稳定性（Drug affinity responsive target stability，DARTS）是一种识别小分子的潜在蛋白质靶点相对快速且直接的方法，它依赖于通过与小分子相互作用而赋予靶蛋白免于蛋白水解的保护。DARTS 通过简单地用感兴趣的化合物和载体对照或无活性类似物处理细胞裂解物的等分试样，然后用蛋白酶对细胞裂解物中的蛋白质进行有限消化来进行。然后通过 SDS-PAGE 分离样品并染色，以鉴定免受小分子蛋白水解的蛋白质条带。最后使用质谱（MS）来鉴定每个条带中存在的蛋白质。这种无偏见的方法已成功用于识别天然产物和其他生物活性小分子的新蛋白质靶标。