海带组蛋白糖组学分析的流程是什么？
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O-糖基化：使用HILIC、VVL-Lectin等方法；
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N-糖基化：使用ZIC-HILIC、ConA、或TiO₂富集。
海带等海藻类样品中的组蛋白糖组学分析，属于典型的“非模式生物+富含多糖杂质”体系，其实验流程需兼顾组蛋白提取的特异性与糖基化修饰的富集灵敏度。下面简要概括标准流程：
一、样品前处理与组蛋白提取
1、样品粉碎与细胞裂解
（1）使用液氮研磨海带组织，尽量避免蛋白降解；
（2）配合高盐缓冲液（如0.4–0.5 M NaCl）裂解细胞核，保留组蛋白。
2、组蛋白富集
（1）酸提取法（如0.2 M H₂SO₄），溶解碱性组蛋白；
（2）丢弃沉淀，超滤或TCA/乙醇沉淀回收组蛋白上清。
3、脱盐与定量
（1）脱盐（如ZipTip、反相C18小柱）；
（2）BCA 或 Bradford 定量蛋白浓度。
二、糖基化肽段制备与富集
1、组蛋白酶解
（1）常用胰蛋白酶 + Glu-C联合酶解，避免肽段过短；
（2）可选使用化学衍生（如propionylation）修饰赖氨酸，增加组蛋白酶解效率与肽段长度。
2、糖肽富集
（1）根据目标糖基化类型选择：
（2）对于复杂样品背景，建议串联富集或多轮洗脱优化特异性。
三、质谱分析（LC-MS/MS）
1、液相色谱
（1）纳升级LC，使用C18反相柱分离；
（2）梯度优化以增强糖肽保留与分离效率。
2、质谱参数
（1）推荐使用Orbitrap类高分辨质谱；
（2）Fragmentation模式建议使用HCD + ETD/EThcD联合；
（3）开启Dynamic Exclusion，避免重复扫描高丰度肽段。
四、生物信息学分析
1、数据库构建与肽段鉴定
（1）若海带无完整参考蛋白库，可先用转录组建库（de novo assembly）；
（2）使用Byonic、pGlyco等专用软件鉴定糖肽。
2、糖基化位点注释与定量
（1）精确定位修饰位点（尤其是O-糖苷键）；
（2）可结合Label-free或TMT/iTRAQ等策略进行定量。
补充说明
1、海带中天然多糖含量高，实验中需注意去除聚糖干扰（可在蛋白层级增加醇沉或苯酚抽提步骤）；
2、海带蛋白含量较低，建议富集前评估组蛋白丰度以免富集失败；
3、组蛋白糖基化较少见，需排除磷酸化、乙酰化等常见修饰干扰。
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