蛋白分析FAQ汇总

• • 做多肽的液质定量，但是送公司的样品和我自己上机的样品信号值相差很大（样品都是一样的），请问会不会是因为我脱盐没脱干净的原因?

  在多肽液质定量分析中，信号值差异很大可能与多个因素有关，脱盐不完全是其中一个潜在的原因。我们可以从以下几个方面来分析和排查这个问题：

• • PEG通过click反应连接了一个多肽，打maldi-tof的时候发现分子量对不上，像是PEG与多肽之间断开了，这是什么原因呢？

  在你的实验中，PEG通过Click化学连接多肽，但在MALDI-TOF检测时发现分子量异常，怀疑是PEG与多肽之间发生了断裂。以下是可能的原因及解决方案：

• • 蛋白跑胶之后做质谱给出中间某一片段序列，又做了N端测序，给了N端的序列。请问可以用这两个信息推测这个蛋白的全长吗？需要怎么做呢？

  通过结合质谱分析得到的肽段序列和N端测序数据，可以推测蛋白质的全长序列。首先，通过质谱分析确认肽段所属的蛋白，并根据N端序列确定蛋白的起始位置。然后，利用肽段与数据库比对推测蛋白的中段和C端序列。如果有必要，还可以参考同源蛋白序列或基因组数据进行验证和补充，最终推测出完整的蛋白质序列。

• • 做WB时先煮了样，又加了loadingbuffer，就放冰箱了，等要用的时候再次加热的温度和时间都是多少呀？

  在Western Blot (WB) 实验中，如果你的样品已经在加入loading buffer后放入冰箱保存，并且准备在后续使用时再次加热，正确的加热条件非常重要，以确保样品保持良好的质量，并且能够有效地在SDS-PAGE中分离。   一、重新加热的温度和时间建议 1、加热温度：通常加热至

• • 二硫键的蛋白是不是大部分都是分泌型蛋白？

  是的，大多数具有二硫键（Disulfide bond）的蛋白确实是分泌型蛋白。大多数具有二硫键（Disulfide bond）的蛋白确实是分泌型蛋白。   具体原因如下： 1、细胞外环境是氧化性的 （1）二硫键是胱氨酸残基之间的共价键（由两个半胱氨酸的巯基 -SH 氧化形成 -S-S-）。

• • 有戊二醛交联蛋白跑Wb的具体protocol吗?

  使用戊二醛（glutaraldehyde）交联蛋白后跑Western blot (WB) 的详细protocol，解答如下： 材料与试剂： （1）戊二醛溶液（通常为25%储备，需现配使用浓度） （2）PBS 或 其他适合的Buffer（避免含有胺类物质，如Tris） （3）裂解液（RIPA、

• • MRM方法建立时关于前体离子如何选择呢

  在建立 MRM（多反应监测，Multiple Reaction Monitoring）方法 时，前体离子选择的标准与流程如下：   一、前体离子选择的核心原则 1、选择肽段特异性强的前体离子： 优先选择唯一映射到目标蛋白质的肽段（proteotypic peptides），避免与其他蛋白质共

• • 如果加了loading后，煮完准备跑wb发现有蓝色沉淀，这是loading加多了吗?

  这种出现蓝色沉淀的现象，很可能是加了过量的Loading Buffer（上样缓冲液），尤其是含有Bromophenol Blue（溴酚蓝）和甘油/蔗糖的蓝色Loading Buffer。   可能原因分析： 1、Loading Buffer 加太多（浓度太高或体积比例不合适） （1）Load

• • 跑液相时，为什么接柱子后在溶剂峰前出现一个小峰？不接柱子跑双通又没有样品峰？

  问题总结： 1、接柱子跑样品，在溶剂峰前面出现小峰； 2、溶剂峰反而比样品峰大； 3、不接柱（双通道直通），跑样品和溶剂，均无明显样品峰； 4、样品是购买现成品，自己溶解。   分析： 1、首先确定：您的样品本身信号是否存在？ 双通（不经过柱子）情况下，直接监测UV或者其他检测器输出，如果样

• • 蛋白做hplc时不出峰，该怎么摸索条件？

  蛋白上HPLC不出峰，属于典型但复杂的问题，涉及流动相、柱类型、样品条件、检测器设置等多个因素。需要严格从实验原理出发，逐步定位。以下是系统性的排查与优化路径，适用于蛋白/多肽类分析。