蛋白分析FAQ汇总

• • 请问wb提取后的蛋白放在负八十后，重新加loading的话还需要再次测量蛋白浓度吗？

  若蛋白冻存前未加上样缓冲液并未变性处理，则重新加loading前应重新测定蛋白浓度以确保上样准确性和重复性；若已加缓冲液并变性，可直接使用，但仍需控制冻融次数，防止蛋白降解。

• • 如果想测定蛋白NC端，样品的条件是怎样的？

  蛋白N端测定的样品准备对实验结果至关重要，具体条件需根据所采用的方法（如Edman降解、质谱法）略作调整。蛋白C端测定的实验挑战性相对更高，因其缺乏类似Edman降解的经典方法，主要依赖质谱法结合特异性策略实现。

• • 蛋白裂解后未测浓度直接冻存，分装会降解吗？

  为避免蛋白因冻融循环造成的降解风险，建议将当前样品在低温下一次性解冻后立即分装，测浓度和后续使用的部分应分别处理，避免回冻。同时，应尽可能补加蛋白酶抑制剂以减缓降解。未来实验中应在裂解后当日完成蛋白定量与分装，确保冻存样品仅经历一次冻融过程，从源头保障蛋白样本的稳定性与实验结果的可靠性。

• • 细胞之间的交互，备样的时候是重组蛋白在铺板以后加入培养基刺激b细胞，还是提取b细胞的膜蛋白再和重组蛋白孵育，再进行纯化呢？

  针对分泌蛋白与b细胞受体的筛选，建议采用体外孵育重组蛋白与b细胞膜蛋白、随后通过亲和纯化结合复合物并进行质谱鉴定的策略以确保结合特异性、降低背景干扰并提高受体识别的成功率。相比刺激活细胞后裂解的方式，该方法更适合用于受体初筛。后续可结合功能验证手段对候选受体进一步确认。

• • 100V60min用的是0.22μM的PVDF膜，一抗孵育是4°12-16h，这些条件可以用在孵育dsHMGB1上的吗?

  你的转膜和抗体孵育条件看起来是比较常见的Western Blot（WB）条件，但针对 dsHMGB1（二硫键高迁移率族蛋白 B1，disulfide HMGB1），需要考虑以下几个关键因素以确保蛋白转移和检测的成功率。

• • 样品未加够缓冲液直接冷冻，还能补加再煮用吗？

  上样缓冲液的不足可能会对样品的完整性和实验结果的可靠性产生一定的影响。我们需要逐步分析这个问题以决定该样品是否还能用，以及如何处理它。

• • 已知蛋白质名称是“重组人IL-2蛋白（高效型）“，蛋白序列代号是“IL2 (P60568-1) ......

  已知蛋白质名称是“重组人IL-2蛋白（高效型）“，蛋白序列代号是“IL2 (P60568-1) (Ala 21-Thr 153)”如何查找其序列和相关文献？要查找重组人IL-2蛋白的氨基酸序列和相关文献，可以按照以下步骤进行：

• • 送样ip胶条质谱(1v1)，胶条是ip组和igg组，得到proteingroup的表格，挖掘40-60kd的差异蛋白，怎么分析？

  对于免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱分析中40-60 kDa差异蛋白的挖掘，可按以下步骤系统分析：

• • 蛋白真空离心浓缩后用0.1%甲酸水溶液复溶但仍浑浊，这样还能进质谱吗？上常规源质谱的蛋白质浓度要求多少？最多能上样多少蛋白？

  在处理蛋白质样品用于质谱分析时，出现样品浑浊的问题可能会影响最终的分析结果。以下是针对你的问题的一些解决方案和建议：

• • 我做的质谱打了两次没打出来但是wb反复验证过是有的而且第二次大大提高了样品蛋白量。我用的是胰酶酶解，目的蛋白是ripk1....

  我做的质谱打了两次没打出来但是wb反复验证过是有的而且第二次大大提高了样品蛋白量。我用的是胰酶酶解，目的蛋白是ripk1，怀疑是样品处理方式不合适，请问有其他样品处理方案吗？RIPK1是一种非常重要的信号转导蛋白，在质谱分析中，如果使用常规胰酶酶解无法成功检测到它，有以下几个可能的原因和改进