100V60min用的是0.22μM的PVDF膜，一抗孵育是4°12-16h，这些条件可以用在孵育dsHMGB1上的吗?

你的转膜和抗体孵育条件看起来是比较常见的Western Blot（WB）条件，但针对 dsHMGB1（二硫键高迁移率族蛋白 B1，disulfide HMGB1），需要考虑以下几个关键因素以确保蛋白转移和检测的成功率。

 

1、转膜条件

你的转膜条件是可行的，但可能需要优化。

（1）dsHMGB1 的分子量约为 25 kDa，属于小分子蛋白，在 WB 过程中可能会被过度转移（blow-through），导致膜上蛋白丢失。

建议： 维持 100V 60min，但如果出现信号丢失，可以尝试提高电压（100-200V）并缩短时间（30-50min）以避免过度转移。

 

（2）膜孔径选择

0.22 μm PVDF 适用于小分子蛋白，如 dsHMGB1；但如果有信号丢失问题，可尝试改用 0.45 μm PVDF 或者 改用 NC（硝酸纤维素）膜，NC膜对低分子量蛋白的亲和力较强。

 

2、一抗孵育条件

你的孵育方式是合适的，特别适用于：提高抗体特异性，降低非特异性背景，适用于大多数蛋白

dsHMGB1 相关注意事项：

（1）HMGB1 有多种亚型和修饰形式（全长、氧化、乙酰化等），不同抗体可能对不同形式的 HMGB1 具有不同亲和力。建议： 确保你的一抗能够识别 dsHMGB1 这一特定氧化状态，否则可能会有较弱的信号。

（2）抗体浓度： 推荐使用厂家建议浓度范围，如果背景高可适当稀释抗体（如1:1000 或 1:2000）。

（3）封闭液选择：

• 5% BSA（牛血清白蛋白）：适用于磷酸化或某些修饰蛋白，可减少非特异性结合。
• 5% 脱脂奶粉：适用于大多数蛋白，但某些情况下可能影响磷酸化蛋白的检测。

 

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