送样ip胶条质谱(1v1),胶条是ip组和igg组,得到proteingroup的表格,挖掘40-60kd的差异蛋白,怎么分析?
对于免疫共沉淀(Co-IP)结合质谱分析中40-60 kDa差异蛋白的挖掘,可按以下步骤系统分析:
一、 数据预处理:筛选目标分子量蛋白
1、补充蛋白质分子量信息
若Excel表中无分子量,通过以下方式添加:
(1)UniProt数据库:批量输入蛋白名称或基因名(如"HSPA8"),检索分子量("Molecular weight"列)。
(2)R包辅助(如UniProt.ws或org.Hs.eg.db)批量获取分子量。
(3)筛选条件:40 ≤ Molecular Weight (kDa) ≤ 60
2、排除低置信度信号
(1)过滤单一肽段鉴定的蛋白(通常可信度低),保留Unique Peptides ≥ 2的条目。
(2)若数据含iBAQ评分,可设定阈值(如iBAQ ≥ 1e5)过滤低丰度噪音。
二、差异蛋白筛选:IP组 vs. IgG组
1、计算富集倍数(Fold Change, FC)
(1)公式:FC = IP组iBAQ强度 / IgG组iBAQ强度(若IgG组为0,可替换为检测下限值,如1e-5)。
(2)过滤条件:FC ≥ 5(经验值,需结合数据分布调整)且IP组iBAQ显著高于IgG组。
2、人工复核非特异性结合蛋白
(1)排除已知常见污染物(如角蛋白、白蛋白)或IgG重链/轻链(~50 kDa和25 kDa)。
(2)参考Contaminant列(若MaxQuant结果中含此标记)。
三、生物信息学分析
1、功能注释富集分析
(1)工具:DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)、Metascape(https://metascape.org/)
(2)输入基因列表,分析富集的GO terms(生物过程、分子功能)、KEGG通路、蛋白复合物。
2、蛋白互作网络构建
使用STRING数据库(https://string-db.org/)上传差异蛋白,观察互作网络,识别核心枢纽蛋白。
四、候选蛋白验证建议
1、Western Blot验证
(1)优先选择:高FC值、关键通路相关、互作网络核心蛋白。
(2)使用IP组和IgG组原始样本验证目标蛋白是否被特异性富集(需匹配分子量范围)。
2、正交实验验证
若目标蛋白有商业化抗体,建议通过免疫荧光共定位或敲低/过表达实验确认功能关联。
五、关键注意事项
1、IgG组重要性:IgG组的信号反映非特异性结合,需严格筛选仅在IP组显著出现的蛋白。
2、数据库匹配:确认蛋白质命名与公共数据库一致(如UniProt标准名),避免基因别名导致的混淆。
3、分子量修正:注意翻译后修饰(如磷酸化、糖基化)可能导致实际分子量与预测值偏差。
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