细胞之间的交互，备样的时候是重组蛋白在铺板以后加入培养基刺激b细胞，还是提取b细胞的膜蛋白再和重组蛋白孵育，再进行纯化呢？

一、实验目的本质

您要寻找的是b细胞膜表面的受体，即那些能够与a分泌蛋白特异结合的膜蛋白，不是下游信号蛋白，因此建议优先关注重组蛋白与膜蛋白的直接物理结合。

 

二、推荐实验策略

首选方案：提取b细胞膜蛋白与标记重组蛋白体外孵育后进行pull-down富集，接质谱鉴定

1、步骤简述

（1）表达纯化带标签的重组蛋白（如His、Flag或Fc等，Fc常用于受体筛选）；

（2）提取b细胞膜蛋白（使用膜蛋白提取试剂盒，尽可能保留构象）；

（3）体外孵育重组蛋白与膜蛋白混合物，模拟结合过程；

（4）用标签抗体或亲和树脂pull-down；

（5）洗涤、洗脱结合蛋白，进行质谱分析。

 

2、优点

（1）物理结合条件可控，结合背景低；

（2）操作相对清洁，便于质谱鉴定；

（3）可用于筛选多个候选受体。

 

3、注意点

（1）保证膜蛋白在非变性条件下提取；

（2）优化孵育时间和缓冲液，避免非特异结合；

（3）引入对照组：如重组蛋白空载体、b细胞膜蛋白+Fc空白等。

 

三、非推荐策略：重组蛋白刺激活细胞后全细胞裂解

该策略常用于观察下游信号反应或转录响应，但不适合用于受体初筛：

原因如下：

1、重组蛋白结合后的受体可能快速内吞或降解；

2、全细胞裂解后背景极高，非膜蛋白亦会混入；

3、无法区分直接结合与信号间接变化。

 

百泰派克生物科技--生物制品表征，多组学生物质谱检测优质服务商

 

相关服务：

蛋白质相互作用分析