请问WB跑出来为什么都是一些空白的框，周围背景是黑色的？

出现这种问题通常意味着在实验中出现了一些技术上的问题，导致膜上显示的信号不符合预期。以下是一些可能的原因以及解决方案：

 

一、抗体相关问题

1、可能原因

• 一抗浓度太低，未能特异性结合靶蛋白。

• 二抗浓度不足或已经失效。

• 抗体质量不佳，对目标蛋白特异性差。

2、解决方案

• 检查一抗和二抗的浓度，按说明书优化稀释比例。

• 确保抗体保存条件正确（避免反复冻融）。

• 更换抗体品牌或批次，必要时使用阳性对照蛋白验证抗体活性。

 

二、膜转移问题

1、可能原因

• 转膜条件不佳（电流、电压不足或时间过短），蛋白未能转移到膜上。

• 电泳条件异常，导致蛋白未按分子量正确分离。

2、解决方案

• 检查转膜设置（电流、电压和时间），确保膜和胶之间无气泡，膜的方向正确。

• 使用Ponceau S染色确认蛋白是否成功转移到膜上。

• 优化电泳条件，确保SDS-PAGE凝胶制作和样品加载无误。

 

三、显影过程问题

1、可能原因

• 底物（如ECL化学发光底物）已过期或保存不当，活性丧失。

• 曝光时间过短或过长，或者显影设备存在问题。

2、解决方案

• 检查底物的保存条件及有效期，建议用阳性样品测试底物活性。

• 调整曝光时间，可从几秒至几分钟进行分级测试。

• 确认显影设备运转正常。

 

四、封闭步骤问题

1、可能原因

• 封闭不足导致非特异性结合，使背景过暗。

• 封闭过度则可能阻碍抗体结合靶蛋白。

2、解决方案

• 使用适量的封闭液（如5%脱脂奶粉或BSA），优化封闭时间和浓度。

• 避免使用过期封闭液，选择适合目标蛋白的封闭方案。

 

五、样品问题

1、可能原因

• 样品中目标蛋白含量过低或在制备过程中发生降解。

• 加样缓冲液配制错误或样品未充分变性。

2、解决方案

• 检查样品裂解和蛋白定量步骤，必要时加入蛋白酶抑制剂。

• 增加样品上样量，确保缓冲液配制正确，并在95℃充分变性。

 

六、实验步骤问题

1、可能原因

• 洗膜过度导致抗体信号被洗掉。

• 抗体孵育或封闭时溶液未充分混合，导致局部区域信号缺失。

2、解决方案

• 缩短洗膜时间或降低洗涤液Tween-20浓度（如从0.1%降至0.05%）。

• 确保孵育和封闭时充分混匀，使用摇床均匀搅拌。

 

七、综合建议：

1、对照组检测： 设置阳性对照、阴性对照以判断具体问题。

2、记录实验步骤： 检查每一步的实验条件是否准确无误。

3、分步优化： 针对转膜、抗体孵育、显影等步骤逐一优化，找到关键问题。

 

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