蛋白分析FAQ汇总

• • LC色谱柱上可以注入多少样品而仍能避免谱带展宽？

  进样量以及最佳流速受到色谱柱尺寸的限制。理想情况下，如果样品与流动相使用相同的溶剂，则大致体积应为：30-100mm色谱柱的样品体积1-3ul；50-150mm色谱柱的样品体积2-12ul；50-250mm色谱柱的样品体积8-40ul。相关服务:蛋白质纯度分析（分子筛/反相色谱）

• • 蛋白纯化——分析色谱和制备色谱的区别是什么？

  分析色谱法用于确定样品中分析物的存在以及可能的浓度。 例如通过尺寸排阻色谱法估计抗体样品中的聚集体/二聚体含量。制备色谱用于纯化足够量的物质以供进一步使用，例如用于功能或结构研究。相关服务:蛋白质纯度和均一性表征

• • 蛋白纯化——上样前用于样品过滤的推荐过滤器孔径是多少？

  对于色谱前的样品制备，应根据色谱介质的珠粒大小选择过滤器孔径。90µm或更大的色谱介质粒度—1µm过滤器孔径；30或34µm色谱介质粒度—0.45µm过滤器孔径；3 µm、10 µm、15 µm的色谱介质粒度或需要超净样品或无菌过滤时—0.22µm过滤器孔径；相关服务:蛋白质纯度和均一性表征

• • 蛋白纯化——我感兴趣的蛋白质在纯化过程中“消失”了，我该怎么办？

  这种情况可能是由于：1、蛋白质已被蛋白酶降解——向样品和缓冲液中添加蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解消化；或通过 Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow 等介质运行样品以去除胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。2、样品制备过程中蛋白质吸附至过滤器——使用不同膜类型的过滤器。 再生纤

• • 抗体纯化——我不知道蛋白A或蛋白G是否最适合我的抗体纯化。我应该怎么办？

  蛋白G是实验室规模的通用抗体捕获的首选，与蛋白A相比，蛋白G与更广泛的真核物种的IgG结合。蛋白G还与更多的IgG亚类结合。相关服务:蛋白质纯度和均一性表征

• • 抗体纯化——洗脱后如何保持抗体活性？

  由于抗体纯化中的洗脱步骤通常需要降低 pH 值，因此存在敏感抗体失去活性的风险。为防止这种情况可以用每毫升洗脱液 60 -200 µl 1 M Tris-HCl 缓冲液(pH 9.0 )d的标准准备收集管，这可以保持抗体活性，因为洗脱液的最终 pH 值将接近中性；或者在优化洗脱条件时确定保持

• • 抗体纯化——如何纯化抗体片段？

  蛋白 L 通过与免疫球蛋白轻链的相互作用结合免疫球蛋白。 它首先是从大消化链球菌的表面分离出来的，并命名为蛋白质 L 的轻链。重链的任何部分都不参与相互作用，这意味着蛋白L比蛋白A或蛋白G结合更广泛的抗体种类。Capto L 亲和色谱法培养基(树脂)可特异性地与抗体 kappa 轻链的可变区

• • 标签蛋白纯化——我需要天然的蛋白质，我能把标签撕下来吗？

  答案是肯定的，但删除标签并不总是那么简单。标签去除总是包括使用序列特异性蛋白酶。凝血因子凝血酶和因子Xa是最常用的，但你需要确保它们各自的切割序列（LVPR↓GS和IEGR↓) 不存在于目标蛋白质中。一些标签，例如谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)-标签可以用更具体的蛋白酶去除，例如 PreS

• • 未标记蛋白质纯化——我打算对我的目标蛋白进行功能研究，但我不能引入标签来简化纯化。我该怎么办？

  如果存在与蛋白质特异性结合的配体，则可以通过单个亲和步骤纯化未标记的蛋白质。 如果无法使用亲和步骤，您可能需要使用多步骤纯化策略。多步骤纯化包括根据目标蛋白的性质选择合适的纯化技术组合。相关服务:蛋白质纯度和均一性表征

• • 未标记蛋白质纯化——未标记的好处是什么？ 标记是否纯化更困难？

  如果您对功能研究感兴趣，标签可能会带来不确定性，或者更糟的是，会改变或完全破坏目标蛋白的功能。此外，标签本身会干扰您以您想要的方式使用蛋白质的能力。当蛋白质被用作治疗剂并且您希望尽可能接近天然形式时，这一点尤为重要。相关服务:蛋白质纯度和均一性表征