蛋白分析FAQ汇总

• • 2D Blue Native/SDS-PAGE复合物分析：求一个protocol

  2D Blue Native/SDS-PAGE 是一种用于分析蛋白复合物和其亚单位组成的技术。以下是该技术的基本实验流程：   1.样本准备： 提取蛋白样本，并使用适当的缓冲液（如含有一定浓度的Digitonin或者Triton X-100的缓冲液）稳定蛋白复合物。   2.第一维：Blue

• • 交联法蛋白相互作用分析具体步骤，要详细步骤

  交联法蛋白相互作用分析的具体步骤如下：   1.样本准备： 调整蛋白样品至适当浓度，一般为0.1至1 mg/mL，以保证交联效果。 如需分析多个蛋白之间的相互作用，将蛋白按比例混合。   2.选择交联剂： 选择适合的交联剂，如BS3或DSS，根据蛋白的特性和实验目的确定。 确定交联剂的

• • 如果论文里显示药物主要激活AMPK通路，是不是要做磷酸化蛋白质组学呢？

  若论文显示药物主要通过激活AMPK通路发挥作用，则进行磷酸化蛋白质组学分析是有必要的。这是因为AMPK通路涉及多种蛋白质的激活，这些激活通常通过磷酸化方式实现。磷酸化蛋白质组学能够帮助鉴定哪些蛋白在药物作用下被磷酸化，进而阐明药物的分子机制。

• • 药物作用前后蛋白变化，是要用哪种类型蛋白组学分析呀？

   药物作用前后蛋白变化的分析通常采用定量蛋白组学方法，主要包括以下两种：1.标记定量蛋白组学（如同位素标记的定量技术，包括iTRAQ和TMT）：这种方法通过化学标记样本中的蛋白质，然后通过质谱分析来定量。该方法可以精确地比较不同样本（例如药物处理前后的样本）中蛋白质的表达差异。2.无标记定量

• • 请教一下blue native page的protocol

  Blue Native PAGE (BN-PAGE) 的实验操作流程主要包括以下步骤：   1.样品准备： 使用温和的洗涤剂（如digitonin或n-dodecyl β-D-maltoside）在4°C条件下裂解细胞，以提取蛋白质复合物。   2.蛋白质提取： 通过离心去除细胞残留和碎片，

• • 今天做WB时，先煮了样，又加了loadingbuffer，就放冰箱了，等要用的时候再煮一下可以吗？

  可以。如果样品已经煮过一次，并存放在冰箱里，建议在使用前再次加热，以确保loading buffer中的SDS和DTT（或β-巯基乙醇）等组分能充分发挥作用，使蛋白质完全变性。在重新加热样品前，需确保样品完全解冻，并轻轻混匀，然后再进行加热，以避免样品中的成分分层或沉淀，影响实验结果。

• • 忘加loading煮沸后加loading煮5分钟冷冻，下次稀释多少倍合适？稀释后需补加loading并煮沸吗？

  1.建议稀释2-5倍。具体稀释比例取决于你的样品浓度和实验要求，通常需要稀释至总蛋白浓度的1-2 µg/µL，以确保电泳结果的准确性和可重复性。 2.稀释后需要补加1X加载缓冲液（loading buffer）。补加loading buffer可以确保样品在电泳时能够正常迁移，并且溴酚蓝染料

• • 进行Western blot实验，稀释煮沸的蛋白原液是用什么稀释?

  进行Western blot实验时，如果需要稀释煮沸的蛋白原液，通常使用以下两种缓冲液之一进行稀释：   1. 蛋白提取缓冲液 使用与最初提取蛋白时相同的提取缓冲液（如RIPA缓冲液、PBS、Tris缓冲液等）进行稀释。有助于保持蛋白质的稳定性。   2. 1X加载缓冲液（Loading B

• • 用DMSO将DSS粉末配制成的溶液浓度虽然是5mM，但加到蛋白体积里面，它不是又被蛋白液体稀释了？那浓度就不是5mM了吧？

  是的，如果直接添加5 mM的DSS母液会被蛋白溶液稀释，无法达到最终5 mM的浓度。理由如下：浓度计算步骤：1.设定变量：2.公式：代入已知值：公式变形：该等式不成立，只有当加入体积都为0时，才能保持5 mM的浓度。如果你想达到在蛋白体积中DSS的浓度为5 mM，只有先使得配制的DSS母液大

• • 蛋白交联试验用DMSO把dss粉末配成浓度5mM的液体，现在蛋白体积为180ul如何稀释母液使得它加入蛋白体积的最终浓度为5mM

  在这种情况下，你不需要对5 mM的DSS母液进行额外的稀释。因为你想要在180 µL的蛋白溶液中达到最终浓度为5 mM的DSS，只需直接添加足够的DSS母液到蛋白溶液中即可。具体步骤如下：   1.计算DSS添加量： 由于母液的DSS浓度已经是5 mM，与你想要的最终浓度相同，直接添加少量母