蛋白分析FAQ汇总

• • 二硫键的蛋白是不是大部分都是分泌型蛋白？

  是的，大多数具有二硫键（Disulfide bond）的蛋白确实是分泌型蛋白。大多数具有二硫键（Disulfide bond）的蛋白确实是分泌型蛋白。   具体原因如下： 1、细胞外环境是氧化性的 （1）二硫键是胱氨酸残基之间的共价键（由两个半胱氨酸的巯基 -SH 氧化形成 -S-S-）。

• • 有戊二醛交联蛋白跑Wb的具体protocol吗?

  使用戊二醛（glutaraldehyde）交联蛋白后跑Western blot (WB) 的详细protocol，解答如下： 材料与试剂： （1）戊二醛溶液（通常为25%储备，需现配使用浓度） （2）PBS 或 其他适合的Buffer（避免含有胺类物质，如Tris） （3）裂解液（RIPA、

• • MRM方法建立时关于前体离子如何选择呢

  在建立 MRM（多反应监测，Multiple Reaction Monitoring）方法 时，前体离子选择的标准与流程如下：   一、前体离子选择的核心原则 1、选择肽段特异性强的前体离子： 优先选择唯一映射到目标蛋白质的肽段（proteotypic peptides），避免与其他蛋白质共

• • 如果加了loading后，煮完准备跑wb发现有蓝色沉淀，这是loading加多了吗?

  这种出现蓝色沉淀的现象，很可能是加了过量的Loading Buffer（上样缓冲液），尤其是含有Bromophenol Blue（溴酚蓝）和甘油/蔗糖的蓝色Loading Buffer。   可能原因分析： 1、Loading Buffer 加太多（浓度太高或体积比例不合适） （1）Load

• • 跑液相时，为什么接柱子后在溶剂峰前出现一个小峰？不接柱子跑双通又没有样品峰？

  问题总结： 1、接柱子跑样品，在溶剂峰前面出现小峰； 2、溶剂峰反而比样品峰大； 3、不接柱（双通道直通），跑样品和溶剂，均无明显样品峰； 4、样品是购买现成品，自己溶解。   分析： 1、首先确定：您的样品本身信号是否存在？ 双通（不经过柱子）情况下，直接监测UV或者其他检测器输出，如果样

• • 蛋白做hplc时不出峰，该怎么摸索条件？

  蛋白上HPLC不出峰，属于典型但复杂的问题，涉及流动相、柱类型、样品条件、检测器设置等多个因素。需要严格从实验原理出发，逐步定位。以下是系统性的排查与优化路径，适用于蛋白/多肽类分析。  

• • 请问脱盐之后怎么知道脱没脱干净？

  脱盐（Desalting）是否彻底，直接影响后续电喷雾效率、峰形、离子抑制等问题。下面从实验角度逐步说明如何判断脱盐是否干净。   一、判断脱盐是否彻底的常规方法 1、质谱检测（最直接有效） 将脱盐前后的样品直接上质谱，观察以下几点： （1）是否出现大面积的强离子抑制现象（如信号弱、只有基线

• • 在做SDS-PAGE时候怎么算蛋白上样量? 上样量多少合适啊?上样体积多少呀?

  解决SDS-PAGE实验中关于“上样量”和“上样体积”的问题，需要根据具体实验类型、实验目的和实验材料来进行分析。为了给出准确建议，需要结合您的样本浓度、凝胶孔尺寸、实验目的（如考察条带清晰度、后续转膜或质谱应用）等信息。  

• • WB蛋白裂解完直接放-80和蛋白变性之后放-80哪种更好？

  蛋白裂解后是直接放入-80℃保存还是经过变性（加SDS样本缓冲液并煮沸）后再保存，主要取决于实验目的和使用计划。若样品仅用于WB且短期内使用完毕，推荐变性后保存；若有多用途或重复使用需求，推荐裂解后立即-80保存，使用前再变性处理更稳妥。

• • 请问SDS-PAGE上样时可以上不同的吗，还是一个胶板都要一样的？

  SDS-PAGE 上样时每个泳道可加载不同样本，实验设计上无须整块胶板样本完全一致。但为确保条带可比性与数据可靠性，需严格控制蛋白量、样品处理条件与加载体积的一致性，同时设置适当对照和Marker以便结果判读。合理规划样品布局是获得清晰、可解释电泳结果的关键。