蛋白做hplc时不出峰，该怎么摸索条件？

蛋白上HPLC不出峰，属于典型但复杂的问题，涉及流动相、柱类型、样品条件、检测器设置等多个因素。需要严格从实验原理出发，逐步定位。以下是系统性的排查与优化路径，适用于蛋白/多肽类分析。

 

一、问题分类与优先排查顺序

1、检测器信号问题（最先排查）

（1）检查是否设定了合适的检测波长（通常为214、220 或 280 nm）；

（2）蛋白没有芳香族残基（如Trp、Tyr）时，在280 nm吸收弱，建议改用214–220 nm；

（3）尝试跑BSA或标准蛋白对照，判断检测器是否正常；

（4）检查背景噪音是否过高或基线漂移，可能掩盖小峰。

优先解决是否真的“没出峰”，还是“出了但信号太弱/错波长/基线太高”。

 

2、柱子类型与匹配问题

不同类型蛋白需匹配不同柱子：

 



 

错误柱型（如用反相柱分析高亲水蛋白）常常无吸附→直接流出→不出峰。

 

3、样品是否进入了柱子？

（1）检查样品是否溶于起始流动相（不能沉淀或聚集）；

（2）检查是否用0.22 μm过滤样品，避免堵柱；

（3）检查进样量是否过低，建议初次测试进样至少20–50 μg蛋白，确保有信号。

 

4、流动相是否合适？

对蛋白类常见系统如下：

（1）反相条件（适合肽段、小蛋白）：

• A液：0.1% TFA（或FA）/水
• B液：0.1% TFA/乙腈
• 梯度：5–60% B，30–60分钟

（2）离子交换条件：

• 起始缓冲液：低盐（如20 mM Tris，pH 根据蛋白IEP调整）
• 梯度洗脱液：含盐（如Tris + NaCl，最高1 M）

若样品pH接近蛋白等电点，蛋白可能不带电，无法结合离子交换柱，也就“跑不出峰”。

 

5、蛋白自身问题

（1）蛋白是否已经聚集或变性？（如冷冻多次、pH变化大）；

（2）可尝试改用变性条件（如加0.1% SDS或6M Urea后上柱）；

（3）若是天然蛋白，注意避免高温、强有机溶剂引起不可逆沉淀。

 

二、建议的摸索流程

初步排查流程建议如下：

1、标准品试跑 → 验证系统与柱子是否正常

2、波长/进样量调整 → 优化检测灵敏度

3、尝试反相系统（如C18）跑肽段类蛋白，设置60分钟梯度

4、如为中等~大蛋白，转用SEC或IEX系统

5、逐步摸索：改变 pH、流动相离子强度、洗脱方式

6、若疑似样品损坏，重新制备新鲜样本测试

 

“蛋白上HPLC不出峰”，多数由柱子类型不匹配、波长设置错误、样品溶解性不足或浓度过低导致。建议从检测器设置→样品状态→柱子选择→流动相设置依次排查，结合标准品试跑，逐步优化条件。

 

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