有戊二醛交联蛋白跑Wb的具体protocol吗?

使用戊二醛（glutaraldehyde）交联蛋白后跑Western blot (WB) 的详细protocol，解答如下：

材料与试剂：

（1）戊二醛溶液（通常为25%储备，需现配使用浓度）

（2）PBS 或 其他适合的Buffer（避免含有胺类物质，如Tris）

（3）裂解液（RIPA、NP-40、或适合你的实验体系）

（4）蛋白酶抑制剂

（5）Western blot所需标准试剂（SDS-PAGE胶、电泳设备、抗体等）

 

1、细胞收集和交联处理

（1）收集细胞

• 用PBS洗细胞两次。
• 收集细胞（贴壁细胞可以用细胞刮刀，悬浮细胞可直接离心）。

（2）戊二醛交联

• 用 0.05%~0.2% 戊二醛工作液（用PBS稀释）重悬细胞或组织。
• 室温或冰上反应 10~15分钟（时间越长交联越强，但可能影响蛋白迁移）。

（3）终止交联

• 加入1 M甘氨酸（Glycine）终浓度为 0.1 M，反应5~10分钟，吸附剩余戊二醛。
• 离心去除反应液，用PBS洗涤细胞两次。

 

2、裂解和蛋白提取

（1）裂解细胞

• 用含蛋白酶抑制剂的裂解液裂解（注意：避免高温，尽量在冰上处理）。
• 裂解20-30分钟后，12,000 g离心10分钟，取上清。

（2）定量蛋白

使用BCA法或其他方法定量。

 

3、SDS-PAGE和Western blot

（1）加样处理

加Loading buffer，95℃变性5分钟（注意：戊二醛交联后蛋白复合物可能不完全解离，需根据实验需要判断是否变性或非变性处理）。

（2）跑胶

按标准SDS-PAGE操作。

（3）转膜 + 封闭 + 抗体孵育

• 转膜（PVDF或NC膜）
• 5%奶粉或BSA封闭1小时
• 一抗孵育过夜，二抗1小时，显色检测

 

注意事项

戊二醛浓度建议低于0.2%，否则可能导致过度交联影响条带迁移或抗体识别位点遮挡。

不要使用Tris缓冲液进行交联反应，它会与戊二醛反应失效。

对照样建议使用未交联样本以比较迁移和信号变化。

 

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