请教您如何做pull down蛋白的质谱分析
一、蛋白质样品准备:
1.在pull-down实验完成后,需要通过多次洗涤步骤清除非特异性结合的蛋白质和其它杂质。
2.使用特定的洗脱缓冲液或直接在SDS-PAGE样品缓冲液中加热,以从亲和树脂或珠子中洗脱目标蛋白质。
二、蛋白质分离(可选,取决于样品的复杂性):
1.如果样品中可能含有大量的非特异性蛋白,还需要进一步纯化,可以使用SDS-PAGE将蛋白质按照分子量分离。
2.凝胶电泳后,可以根据需要切割特定的凝胶条带,通常是基于目标蛋白质的预期大小。
三、蛋白质消化:
1.如果使用SDS-PAGE,需要从凝胶中切除条带并进行进一步的处理(脱色,水解等)。
2.在凝胶外或凝胶内使用特定的蛋白酶(通常是胰蛋白酶)对蛋白质进行消化,切割成肽段。
3.消化后,肽段需要从凝胶片中提取出来(如果进行了凝胶分离),通常通过多次用乙酰化水和乙腈的混合物进行提取。
四、肽段纯化:
1.使用C18 ZipTip或SPE柱(固相萃取)去除杂质,如盐和洗脱缓冲中的残留物,因为这些物质可能会干扰质谱分析。
2.纯化后,样品通常在低体积的有机溶剂(如0.1%甲酸的乙腈/水溶液)中重新悬浮。
五、质谱分析:
1.利用液相色谱(LC)与质谱(MS)的联用技术,肽段首先根据其化学性质被分离,然后被引入质谱仪进行检测。
2.液相色谱条件需要根据样品的复杂性和所使用的质谱仪来优化。
3.在质谱分析阶段,肽段被电离(通常是通过电喷雾离子源)并进入飞行管,根据质荷比(m/z)被检测。
六、数据分析和蛋白鉴定:
收集到的原始质谱数据需要使用特定的软件进行分析,例如MaxQuant, Proteome Discoverer或者Mascot等。
软件会将检测到的肽段质谱与蛋白质数据库进行比对,以确定每个肽段的身份,从而推断出原始蛋白质的组成。
鉴定结果通常需要进一步的验证,例如通过评估匹配的质谱图,确认鉴定的蛋白质是否有生物学意义等。
这个过程高度依赖于仪器的类型、样品的复杂性、预期的敏感性和准确性,因此在实践中可能需要对特定步骤进行调整和优化。
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