用什么实验可以验证蛋白与蛋白相互作用,如何进行?
一、共免疫沉淀（Co-IP）：
共免疫沉淀是一种用于研究蛋白质之间相互作用的实验方法。实验过程如下：
1.制备细胞提取物，含有待测蛋白质。
2.向细胞提取物中加入特异性抗体，靶向其中一个待测蛋白质。
3.将抗体与蛋白质孵育，使其结合。
4.加入蛋白A/G磁珠，与抗体结合。
5.通过磁力沉淀磁珠，以及与之结合的抗体和目标蛋白质。
6.洗涤磁珠，去除非特异性结合。
7.用SDS-PAGE溶液释放蛋白质，并进行免疫印迹（Western blot）分析，以检测目标蛋白质及其相互作用的蛋白质。
二、双杂交（Yeast two-hybrid）：
双杂交是一种利用酵母细胞遗传系统研究蛋白质之间相互作用的方法。实验过程如下：
1.将两个待测蛋白质分别与酵母转录因子的DNA结合域（BD）和激活域（AD）融合。
2.将这两个融合蛋白质表达载体转化到同一酵母细胞中。
3.在特定选择性培养基上培养酵母细胞。
4.观察酵母细胞的生长情况。如果两个待测蛋白质相互作用，BD和AD将聚集在一起，启动特定基因的转录，使酵母细胞在选择性培养基上生长。
三、荧光共振能量转移（FRET）：
1.荧光共振能量转移是一种依赖于距离的荧光技术，可以用于研究蛋白质之间的相互作用。实验过程如下：
2.将待测蛋白质分别标记为供体荧光染料和受体荧光染料。
3.将标记的蛋白质在适当的条件下混合，使其有机会发生相互作用。
4.使用荧光光谱仪或共聚焦显微镜测量荧光信号。
5.如果两个蛋白质相互作用，它们之间的距离将在一定范围内（通常在1-10纳米），导致供体荧光染料向受体荧光染料转移能量。这种能量转移可以通过测量荧光强度变化或寿命改变来检测。
四、生物层析法（Biolayer Interferometry, BLI）：
1.生物层析法是一种实时监测蛋白质之间相互作用的方法，基于光学干涉原理。实验过程如下：
2.将一个待测蛋白质固定到传感器表面。
3.通过测量传感器上的光学干涉信号，监测另一个待测蛋白质与固定蛋白质的结合过程。
4.记录实时的结合曲线，可以用于计算蛋白质之间相互作用的结合常数和速率常数。
五、表面等离子共振（SPR）：
1.表面等离子共振是一种实时监测蛋白质相互作用的方法，基于表面等离子共振光学原理。实验过程如下：
2.将一个待测蛋白质固定到传感器芯片表面。
3.通过测量传感器芯片上的表面等离子共振信号，监测另一个待测蛋白质与固定蛋白质的结合过程。
4.记录实时的结合曲线，可以用于计算蛋白质之间相互作用的结合常数和速率常数。
六、调控体系（TAP, Tandem Affinity Purification）：
1.调控体系是一种基于双重亲和纯化技术的方法，可以用于鉴定蛋白质复合物。实验过程如下：
2.将待测蛋白质与一个双重亲和标签融合（例如，蛋白A和酵母酸性蛋白质，ProtA-TEV-ProtC）。
3.在生物体内表达融合蛋白质，然后提取细胞裂解物。
4.使用两种不同的亲和层析柱依次纯化蛋白质复合物：首先，将裂解物通过蛋白A亲和层析柱，与融合标签中的蛋白A结合。接着用TEV蛋白酶切割融合蛋白质，释放蛋白质复合物。然后将切割后的蛋白质复合物通过蛋白C亲和层析柱，与融合标签中的蛋白C结合。最后，洗脱纯化的蛋白质复合物。
5.使用质谱（MS）或免疫印迹（Western blot）等方法分析蛋白质复合物成分，以确定蛋白质之间的相互作用。
七、荷包蛋白质互作实验（LUMIER, Luminescence-based mammalian interactome）：
1.荷包蛋白质互作实验是一种基于荧光酶报告的筛选技术，用于研究哺乳动物细胞中的蛋白质相互作用。实验过程如下：
2.将待测蛋白质分别与荧光素酶（如Renilla荧光素酶）和免疫球蛋白结合蛋白（如Protein A）融合。
3.将融合表达载体转染哺乳动物细胞，使待测蛋白质在细胞内表达。
4.提取细胞裂解物，将荧光素酶标记的蛋白质与免疫球蛋白结合蛋白标记的蛋白质混合。
5.用免疫沉淀法将免疫球蛋白结合蛋白标记的蛋白质沉淀下来。
6.检测沉淀物中荧光素酶的活性。如果两个蛋白质相互作用，荧光素酶活性会显著增加。
这些方法都有其优缺点，可以根据实际需求和实验条件选择合适的方法来验证蛋白质之间的相互作用。
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