蛋白与蛋白互作分析:Co-IP与Pull-down

许多细胞事件,如细胞增殖、细胞分化和细胞死亡,都是由蛋白与蛋白间相互作用控制的。细胞内蛋白质的一些动态特征可以通过相互作用而改变。例如,底物结合和催化活性可以被改变;产生新的结合位点,改变蛋白质对底物的特异性。一些蛋白质可以失活来调节其他基因的表达。只有当蛋白与蛋白间相互作用被调节时,正常的细胞活动才能进行。免疫共沉淀(Co-IP)和下拉法(Pull-down)是用于确定稳定的蛋白与蛋白相互作用的分析方法。

免疫共沉淀(Co-IP):免疫共沉淀在体外检测两种蛋白质之间特定相互作用的存在。Co-IP的原理是当细胞在非变性条件下裂解时,许多细胞内蛋白互作被保留下来。如果蛋白X由一个抗体免疫沉淀下来,与蛋白X结合的蛋白Y也可以被沉淀下来。通过研究蛋白Y,可以确定蛋白X和Y之间的相互作用。
优点:1. 在Co-IP分析中,诱饵蛋白和猎物蛋白是天然构象的;2. 诱饵蛋白与猎物蛋白间的相互作用发生在体内,受外界影响较小;3. 不需要克隆和异源表达,如果有抗体,该分析很快。
缺点:1. 低亲和力或蛋白质间短暂的互作可能不会被检测到;2. 由于不能排除其他蛋白参与的可能,因此Co-IP的结果不能确定相互作用是直接的还是间接的;3. 该方法非通用,需要有特定的抗体。

Pull-down:Pull-down试验是一种体外亲和纯化方法,使用诱饵蛋白来富集与诱饵蛋白互作的蛋白质。Pull-down试验的基本原理是使用与标签(如GST标签、His标签和生物素标签)融合的蛋白质固定在亲和树脂上作为诱饵蛋白质。当目标蛋白或细胞裂解液流过时,能够与诱饵蛋白结合的猎物蛋白可以被捕获并被拉下。洗脱后,使用蛋白质印迹或质谱分析,可以证实预测的相互作用或发现以前未知的相互作用。
优点:1. 能纯化低丰度蛋白质复合物;2. 常用于体外转录或翻译系统。
缺点:1. 蛋白质标签的存在可能会影响与内源性复合物的竞争结果;2. 并不能真正反映蛋白质之间的相互作用,因为它们不一定会在体内相遇,所以这并不意味着它们在生理上是结合的。

相关服务

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GST pull-down蛋白相互作用分析
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