溶液中多肽含量的测定
多肽含量（Peptide Content）是指样品中肽类物质相对于非肽类物质所占的百分比，另一个容易与之混淆的概念是多肽纯度，即指使用 HPLC 分析法在 220 nm 处检测到的目标多肽的含量（220 nm 是肽链的吸收波长），两者需要加以区分。溶液中多肽含量的测定是生物化学、药物研发及临床诊断等领域中至关重要的环节。以下详细介绍几种常用的溶液中多肽含量的测定方法。
一、凯氏定氮法
凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。操作相对比较简单；实验费用较低；结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法；用改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微量的蛋白质。凯氏定氮法只是一个氧化还原反应,把低价氮氧化并转为氨盐来测定，而不能把高价氮还原为氮盐的形式，所以不可以测出物质中所有价态的氮含量。
图1. 凯氏定氮法原理图
二、考马斯亮蓝染色法（Coomassie Blue Staining）
考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465 nm 变为 595 nm。在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465 nm 的形式转变成吸收峰为 595 nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595 nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000 μg/mL，最小可测2.5 μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。但该方法会受到核酸的干扰，清洁剂的影响也不可忽视，不适用于小肽的含量测定。
图2. 考马斯亮蓝染色反应示意图
三、BCA法（Bicinchoninic Acid Assay）
BCA法利用蛋白质中的肽键可将硫酸铜中的Cu²⁺还原成Cu⁺（反应依赖于温度），其中减少的Cu²⁺的量与溶液中存在的蛋白质的量成比例。接下来，每个Cu⁺离子都与两个分子的bicinchoninic acid螯合物形成紫色复合物，可强烈吸收562 nm波长的光。
图3. BCA法测定蛋白质浓度示意图
四、紫外分光光度法
蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同蛋白质吸收波长略有差别），在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯比尔定律，可以用于确定肽键的浓度，进而推算出多肽的含量。该测定法简单灵敏快速选择性高，稳定性好，不消耗样品，测定后仍能回收使用，适用于低浓度或低体积的多肽溶液，这种方法的缺陷在于只能检测含有芳香族氨基酸的多肽的浓度。在多肽是纯净的、含有芳香族氨基酸并已知消光系数的基础上，紫外吸收法可提供一个快速、粗略的浓度结果，但是要求实验者在使用时避免污染比色皿，以免影响读数。紫外吸收法也会受到 pH 与离子强度的干扰，尤其是核酸的影响。再者，如果样本数量大，使用紫外吸收法的操作时间将会延长，十分耗时。
图4. 紫外分光光谱仪展示图
五、色谱法
液质联用色谱法是多肽分析的常用方法之一，液质联用由液相色谱与质谱两部分组成，采用色谱分离物质，再由质谱将化合物形成的离子和碎片离子，按荷质比进行分离检测。该方法能够探测到化合物分子量和结构的相关信息，用于定性和定量分析，但多肽类药物易吸附于容器壁、吸管端及LC-MS 系统中，导致样品损失，使得仪器灵敏度降低。因此，在采用液质联用时要注意容器的材料、肽类结构，还要注意溶液的浓度、pH、温度和离子强度等。另外还有二维凝胶电泳 - 质谱法、高效毛细管电泳-质谱联用等方法。
图5. 色谱法测定多肽含量流程图
除了上述方法外，还有一些其他的方法也可以用于多肽含量的测定，比如利用红外光谱法、配体结合法和发色团（如色氨酸和酪氨酸）的消光系数进行计算，或者通过福林酚试剂法来测定多肽含量。
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