从样本到结果：鸟枪蛋白质组学技术全流程解析

鸟枪法蛋白质组学（Shotgun Proteomics）是当前蛋白质组研究中应用最广泛的策略之一。它通过将复杂蛋白混合物酶解成肽段，并结合液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）实现大规模蛋白质鉴定与定量，广泛用于疾病机制解析、生物标志物筛选及功能蛋白研究。本文系统梳理鸟枪蛋白质组学从样本处理到数据解析的全流程，帮助科研人员理解各关键环节的技术要点与优化策略。

 

一、样本制备：确保下游分析的起点准确

1、蛋白提取

不同样本类型（如组织、细胞、体液）需采用定制化裂解方案，常见裂解方法包括RIPA缓冲液、尿素/硫脲体系或SDS裂解液，需兼顾蛋白回收率与变性效率。样本操作全程应低温进行，以防蛋白降解或修饰干扰后续分析。

 

2、蛋白定量与质控

采用BCA或Bradford方法对总蛋白浓度进行准确测定，确保各样本加载量一致。SDS-PAGE可作为质控手段，评估蛋白完整性与降解情况，是构建高质量数据的前提。

 

二、蛋白酶解：生成质谱可检测肽段

鸟枪法分析的核心是肽段而非整蛋白。高效、标准化的酶解策略对于保证重复性与定量准确性至关重要。

1、还原与烷基化

利用DTT或TCEP等还原剂破坏蛋白二硫键，随后使用碘乙酰胺（IAA）进行烷基化，封闭巯基，防止重构二硫键，提高酶解一致性。

 

2、胰酶酶解

胰酶（Trypsin）为最常用的酶解工具，推荐的酶与蛋白质量比为1:50至1:100（w/w）。在37°C条件下孵育12~16小时 可实现较为充分的酶解。需确保pH、温度与离子强度适配，以实现肽段生成的最大化。

 

三、肽段纯化与分级：降低复杂度提升鉴定深度

1、固相萃取（SPE）

SPE用于去除盐离子、脂质及干扰物质，并富集有效肽段。未纯化肽段可能导致质谱抑制效应，影响峰识别与定量稳定性。

 

2、分级策略

为提升蛋白覆盖率与鉴定通量，可采用高pH反相分级、强阳离子交换（SCX）或电泳分离技术，将复杂肽混合物按理化性质预先分层，显著提升数据质量，尤其在复杂组织样本中效果显著。

 

四、LC-MS/MS分析：高分辨率检测肽段特征

1、液相色谱分离

纳升流液相色谱（nanoLC）结合C18色谱柱实现高分辨分离，通过优化梯度洗脱时间与缓冲液体系，有效提升肽段峰形与重现性。

 

2、串联质谱扫描

采用数据依赖采集（DDA）或数据独立采集（DIA）模式获取MS/MS谱图：

• DDA适合深度鉴定研究，依赖实时选择最强信号肽进行碎裂；

• DIA可覆盖更多低丰度肽段，适用于大样本定量与临床队列分析。

高分辨质谱仪的使用显著提升肽段鉴定准确性与定量动态范围。

 

五、数据分析：从原始谱图到蛋白鉴定与定量

1、肽段谱图匹配

使用搜索引擎将MS/MS谱图与理论肽段数据库进行比对，FDR控制（通常设定在1%）确保结果可靠。数据库选取需与物种及样本背景一致。

 

2、蛋白推断

多个肽段映射到同一蛋白以确认其存在，需注意共享肽段的归属策略。常见算法包含最大似然法、概率模型或分数加权系统。

 

3、定量方法选择

• 标签法（如TMT、iTRAQ）适合多样本定量，批间差小；

• Label-free定量则无需额外标记，适合探索性研究；

• DIA定量依赖谱库构建与算法模型，可实现高重复性与灵敏度。

 

六、生物信息学分析：赋予数据生物学意义

定量结果本身并不能揭示机制，需结合系统性数据挖掘与功能注释完成深入解析。

1、差异蛋白筛选

通过统计学方法（如t检验、ANOVA）筛选显著变化蛋白，结合火山图、主成分分析（PCA）等方式进行数据降维与可视化。

 

2、功能富集分析

GO（Gene Ontology）与KEGG通路富集揭示差异蛋白所涉及的生物过程、分子功能与信号通路，是理解调控机制的重要手段。

 

3、蛋白互作网络构建

构建PPI网络可揭示核心调控蛋白与功能模块，结合网络拓扑分析可进一步挖掘潜在靶点或关键节点，为后续实验验证提供依据。

 

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