如何开展Shotgun蛋白组数据库搜索与FDR控制？

Shotgun蛋白组学实验中，质谱仪获取的仅是肽段碎片的m/z信号，这些数据本身无法直接告诉我们样本中有哪些蛋白质。真正实现蛋白鉴定的关键步骤是Shotgun蛋白组数据库搜索，即通过算法将质谱谱图与理论肽段进行比对，从而反推出原始蛋白组成。然而，数据库匹配并非“绝对正确”，由于谱图复杂性、测量误差及生物背景干扰，假阳性识别不可避免。因此，实施有效的FDR控制（假发现率）成为蛋白质组学数据可信度的核心保障。

一、数据库搜索

1、数据库搜索的基本流程

Shotgun蛋白组数据库搜索通常包括以下步骤：

（1）将实验获得的MS/MS谱图（通常为.mgf、.raw或.mzML格式）输入至搜索引擎；

（2）根据设定的蛋白质数据库（如UniProt、人类参考蛋白数据库等），计算出理论肽段的碎裂谱图；

（3）将实验谱图与理论谱图逐一匹配，并打分（Score）；

（4）根据打分结果判定匹配的可靠性，输出候选肽段与蛋白质列表。

2、常用数据库搜索引擎



3、Shotgun蛋白组数据库搜索的选择原则

（1）推荐使用物种特异性数据库（如Human Uniprot FASTA），确保搜索效率；

（2）添加污染库（contaminant）以识别实验过程引入的常见背景（如胰蛋白酶、角蛋白）；

（3）进行反向或随机化数据库构建以支持FDR计算。

二、FDR控制

1、什么是假发现率（FDR）？

FDR（False Discovery Rate）指的是在被鉴定为“阳性”（即鉴定成功）的肽段或蛋白中，实际上为错误匹配的比例。举例说明：若鉴定出1000个肽段，FDR为1%，意味着可能有10个是假阳性。

2、为什么FDR控制至关重要？

（1）避免数据污染和过度解释；

（2）提高科研结果的可重复性与发表可信度；

（3）满足SCI期刊对质谱鉴定质量的评审要求。

3、如何实现FDR控制？

（1）Target-Decoy搜索策略（靶标-诱饵法）

这是目前最常用的FDR估算方法。

原理：

• 在数据库中人为加入“虚假”蛋白质序列（如将真实蛋白反向排列）作为诱饵（decoy）；

• 同时对实验数据进行“靶标+诱饵”数据库搜索；

• 假设诱饵序列被匹配的频率即为假阳性水平；

• 通过统计靶标与诱饵匹配的数量比来估算FDR。

实现工具：

• MaxQuant、Mascot、Proteome Discoverer等均自动内置此策略；

• 可设定1%、5%或更严格的FDR阈值（一般推荐<1%）。

（2）肽段层级 vs. 蛋白层级 FDR

FDR控制可在不同层级执行：



（3）打分策略与过滤标准

不同搜索引擎有不同的打分系统：

• Mascot：Ion Score、Expect值

• MaxQuant：Posterior Error Probability（PEP）、Score

• SEQUEST：Xcorr、DeltaCn值

建议结合多种打分指标设定过滤门槛，同时使用最低识别肽段数≥2作为蛋白鉴定标准，提升可靠性。

三、Shotgun蛋白组数据库搜索与FDR控制中的常见问题与优化建议



百泰派克生物科技在数据库搜索与FDR控制中的实践经验

百泰派克生物科技结合高分辨率质谱平台（如Orbitrap Exploris 480、timsTOF Pro 2），为客户提供标准化、可追溯的蛋白鉴定数据：

✅ 使用UniProt+Contaminant+Decoy构建三层级数据库，确保鉴定覆盖率与准确率并重；

✅ 默认执行PSM、Peptide、Protein三个层级的1% FDR控制，确保发表级别数据质量；

✅ 根据项目需求可进行开放搜索（Open Search）与翻译后修饰识别（PTM）；

✅ 提供详细的数据库匹配报告、FDR曲线图、蛋白组信息矩阵等生信结果。

Shotgun蛋白组数据库搜索是将质谱数据转化为科学结论的关键步骤，而FDR控制则是这一步的质量把关者。一个好的蛋白组实验不仅要“鉴定得多”，更要“鉴定得准”。百泰派克生物科技坚持数据驱动、质量优先的理念，从数据库构建、搜索参数优化到FDR分层控制，力求为每一位科研用户交付高可靠性、高可重复性、高发表价值的蛋白组数据。

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