如何进行Shotgun蛋白组学样本前处理与酶切策略优化？

在Shotgun蛋白组学中，虽然质谱仪性能至关重要，但前端样本处理与蛋白酶解策略往往才是决定实验质量的第一道关卡。尤其是在面对复杂、生物学异质性强的样本类型（如组织、体液、临床样本）时，样本前处理策略是否得当，直接影响蛋白提取效率、肽段覆盖度及最终蛋白鉴定数量。

一、样本前处理

1、样本裂解：最大化释放全蛋白

Shotgun蛋白组学不同样本类型所需裂解条件差异显著：

（1）细胞样本：通常使用含SDS或尿素的裂解液，辅以超声波或机械匀浆。

（2）组织样本：需先冷冻研磨，结合强裂解缓冲液（如RIPA、8 M尿素）以破坏细胞结构。

（3）血清/血浆：由于高丰度蛋白干扰，建议加入去除白蛋白/球蛋白的富集步骤。

优化建议：

• 保持全程低温操作，避免蛋白降解。

• 添加蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂，保留翻译后修饰（PTMs）。

• 采用滤筒法（FASP）或磁珠法（SP3）等可大幅提高裂解效率与后续兼容性。

2、蛋白质定量：精确输入，保障批次一致性

（1）推荐使用BCA法进行定量，兼容多数裂解液组分。

（2）每组样本输入量建议在50–100 μg蛋白，避免过量或不足影响酶解效率。

二、酶切策略优化

1、选择合适的蛋白酶与酶切方式

Shotgun蛋白组学最常用的是胰蛋白酶（Trypsin），其识别位点为K/R（除P后），优势在于：

（1）酶切特异性高

（2）得到的肽段适合MS分析（500–3000 Da）

为提高覆盖率，可采用联合酶切策略：



2、控制酶解参数：时间、温度与酶比的平衡



注意：

• 使用MS-grade高纯度胰蛋白酶，避免非特异切割污染。

• 酶切过程可在离子交换缓冲液或AmBic缓冲液中进行，提高后续MS兼容性。

三、肽段净化与脱盐

1、酶解完成后，需去除以下干扰因素：

（1）盐离子（Na⁺、Cl⁻）

（2）胶体杂质（SDS、尿素）

（3）小分子代谢物或缓冲组分

2、常用方法：

（1）C18反相固相萃取柱（SPE）：保留肽段，去除盐分。

（2）StageTip或OMIX tips：微量样本高效脱盐。

（3）磁珠富集法（如SP3）：自动化兼容性好，适用于高通量实验。

（4）脱盐后的肽段浓度建议： 0.5–1 μg/μL，适合纳流液相进样浓度范围。

百泰派克生物科技Shotgun蛋白组学，样本处理解决方案

百泰派克生物科技针对不同样本类型（组织、细胞、血清、外泌体等）开发了模块化的前处理流程，确保蛋白提取最大化、酶解效率稳定，并实现以下关键质量控制：

✅ 自动化样本裂解平台，适配96孔处理模式，提升大规模项目效率

✅ 采用高纯度MS级蛋白酶与双酶酶解体系，覆盖率提升15%以上

✅ 标准化酶解QC流程，包括肽段长度分布、酶解效率比率等质量评估

✅ 样本处理全流程兼容Label-Free、TMT、DIA等多种定量策略

✅ 提供前处理+质谱一站式服务，避免跨平台误差，数据质量更具一致性

Shotgun蛋白组学的成功不仅依赖质谱平台性能，更依赖样本前处理和酶切策略的科学设计与严谨执行。通过优化裂解方案、精准控制酶解参数与有效去除干扰物，可以显著提高蛋白鉴定数量、数据重复性与下游生物信息分析的可信度。百泰派克生物科技致力于提供稳定可靠、可追溯、可量化的Shotgun蛋白组学分析服务。欢迎联系我们获取项目评估、流程建议或样本预处理标准操作方案，助您轻松迈入高质量蛋白组学研究的大门。

百泰派克生物科技--生物制品表征，多组学生物质谱检测优质服务商

 

相关服务：

Shotgun鸟枪法蛋白质鉴定