自上而下VS自下而上蛋白质组学

蛋白质研究是分析化学中最具挑战性的主题之一。最初的蛋白质研究专注于开发能够分离和鉴定蛋白质序列的技术。Edman降解法是一种蛋白质氨基酸序列分析的革命性方法。通过不同酶解结合蛋白质消化,高效液相色谱(HPLC)分离肽段后进行Edman降解可以确定蛋白质的完整序列。20世纪90年代,质谱法由于操作简、结果可靠,代替了Edman降解法用于蛋白质鉴定,质谱分析法还可对样品中的蛋白质进行收集。多年来,人们开发了更多的蛋白质研究技术,并将蛋白质领域内研究定义为“蛋白质组学”。蛋白质组学在过去用于定义蛋白质组的大规模研究,但现在是指从小规模到大规模的各项蛋白质研究。

自下而上(bottom-up)和自上而下(top-down)是两种基于生物质质谱分析的蛋白质组学方法。自下而上法,也称为鸟枪法(shotgun),是蛋白质组学研究中广泛使用的质谱技术,自下而上法是将大蛋白片段水解/酶解为肽段,然后进行分析的传统方法。自上而下直接对完整的蛋白质进行分析,包括翻译后修饰蛋白质和其他大片段蛋白质,而不仅仅是肽段。

自下而上蛋白质组学

自下而上法的基本过程是将蛋白质混合物消化成肽混合物;对肽混合物进行色谱分离和离子化后,通过串联质谱分析生成肽指纹图谱以进行肽鉴定。最后,从鉴定出的肽中推导出可能的蛋白质。该方法可在短时间内获得大量的识别结果。

在计算步骤中,现有的图谱分析方法包括序列库搜索、图库搜索(最常用)、从头测序以及与容错搜索相结合的从头测序方法。一些经典的搜库软件包括MASCOT、SEQUEST、X! Tandem等。

以shotgun技术路线为例,搜库的基本过程如下:

1.将数据库中的候选蛋白质序列切成肽,并模拟切下的肽片段谱图。
2.根据谱图的相似度对实验谱图进行匹配和评分。通过特定的肽质量控制方法获得高度可靠的肽鉴定结果。
3.根据肽和蛋白质的氨基酸序列之间的对应关系推导出蛋白质。

自下而上策略是目前最成熟和广泛应用于蛋白质鉴定,表征翻译后修饰以及进行相对和绝对定量的分析策略。但自下而上分析策略的缺陷也限制了其潜在的应用范围。

自上而下的蛋白质组学

自上而下的蛋白质组学

尽管目前已开发了多种蛋白质分离技术,但是大多数技术都没有能力从复杂的混合物中分离出蛋白质。自上而下蛋白质组学策略就是用于表征混合物中的多个完整蛋白。在自上而下蛋白质组学中,完整的蛋白质首先通过反相液相色谱从复杂的生物样品中分离出来,然后通过电喷雾电离(ESI)或基质辅助激光解吸/电离(MALDI)技术直接电离。产生的离子通过碰撞诱导解离(CID)、高能碰撞诱导解离(HCD)、电子俘获解离(ECD)或电子转移解离(ETD)进行碎片化,并在串联质谱中进行分析。该方法在蛋白质鉴定、分析、序列分析和翻译后修饰表征方面有很大潜力。

自上而下蛋白质组学Vs自下而上蛋白质组学

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自下而上和自上而下蛋白质组学的工作流程(Ashley等,2016)

自上而下和自下而上的策略都有各自的优势和局限性。考虑到两种策略提供的信息的互补性,逐渐衍生出一种“中间向下”的蛋白质组学策略,在这种策略中,蛋白质受到酶(如LysC)的有限蛋白水解作用,产生大小5-20 kDa的产物。然后使用自上而下的方法对这些肽进行测序,该法具有高序列覆盖率和保留翻译后修饰信息的优势。我们可以根据设备和特定分析要求选择合适的蛋白质研究策略。

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