怎么鉴定加药与不加药情况下二聚体的含量呢？

要准确比较加药与不加药条件下二聚体含量，需明确：蛋白性质（是否可溶、是否易聚集）、检测环境（体外纯化蛋白还是细胞/组织裂解液）、目标是否为定性或定量分析。通常可考虑以下策略：

 

一、凝胶电泳结合定量

1、原理：二聚体相对单体在非还原、低变性条件下可保持构象差异。

2、方法：

• 使用非还原 SDS-PAGE或Native-PAGE分离；

• 染色后用图像分析软件（如 ImageJ）对单体、二聚体条带进行灰度积分，计算二聚体比例；

• 必须保证上样量在线性范围，避免聚集或过量上样导致假阳性。

3、适用性：简单直观，但对弱结合或动态平衡二聚体易低估。

 

二、SEC（Size-Exclusion Chromatography）/ HPLC

1、原理：按分子量分离，可区分单体、二聚体峰。

2、方法：

• 通过标准曲线（外标蛋白或已知浓度的纯化目标蛋白）实现峰面积定量；

• 建议联用MALS（多角度光散射）或UV 检测提高准确性。

3、适用性：可提供更准确的比例，能检测药物诱导的二聚化转变。

 

三、交联结合质谱（Crosslinking-MS）或化学交联+Western

1、原理：药物可能改变二聚化动态，交联固定后可检测特定二聚体。

2、方法：

• 使用温和交联剂（如 DSS, BS3），固定相互作用；

• 结合 SDS-PAGE 或质谱，分析交联产物比例。

3、适用性：适合短暂或低亲和力二聚体，但交联条件需严格优化。

 

四、生物物理方法

1、MALS（多角度光散射）：可直接给出溶液中分子量分布；

2、AUC（分析超速离心）：测沉降系数，区分单体/二聚体；

3、适用性：精确，但需要专业仪器与纯化样品。

 

建议流程

1、首先确认样品状态（是否需保持原始结合状态，药物是否稳定存在）。

2、以 SEC-MALS 或 Native-PAGE 定量作为首选；若条件受限，可结合非还原 SDS-PAGE + densitometry 进行估算。

3、建议平行设置生物学重复，并在两组条件下保持等量总蛋白与相同缓冲体系。

 

百泰派克生物科技——生物制品表征，多组学生物质谱检测优质服务商

 

相关服务：

交联法蛋白相互作用分析