做免疫共沉淀实验时，不小心同时加了磁珠和抗体到样本里孵育过夜，结果能用吗？

这种情况下实验结果可能存在较大不确定性，需具体分析如下：

 

一、操作偏差说明

标准Co-IP流程中，抗体应先与样本孵育形成免疫复合物，之后再加入预洗过的Protein A/G磁珠以结合抗体，减少非特异吸附。您描述的操作中，抗体和磁珠同时加入样本孵育过夜，会导致以下问题：

1、抗体优先被磁珠捕获

若抗体与磁珠结合能力较强（尤其是Protein A/G beads），抗体可能被大量结合在磁珠上，来不及与靶蛋白结合，导致pull-down效率下降。

 

2、非特异结合增加

长期孵育（如过夜）且缺乏洗脱前的“预结合”步骤，增加非特异蛋白直接吸附在磁珠表面的风险，背景噪音上升。

 

3、抗体封闭能力不足

在未先形成抗原-抗体复合物的条件下，易发生磁珠表面空位直接吸附样本中的高丰度蛋白，影响特异性。

 

二、是否仍可使用：视实验目的与信号强度而定

• 若是用于检测高丰度蛋白互作（例如Flag-tagged重组蛋白与强相互作用伴侣），可能仍能看到特异band。

• 若检测低丰度/内源性蛋白或弱相互作用复合物，该种偏差通常显著影响富集效率，建议不直接使用。

 

三、建议操作

1、可做小量Western验证该批样本中是否成功富集目标蛋白或相互作用伴侣；

2、如信号弱或背景高，建议重新制备样本，严格按以下步骤操作：

• 样本加抗体，4℃孵育 2–4 h 或过夜；

• 加入预洗的Protein A/G磁珠，再孵育1–2 h；

• 洗涤、洗脱并做Western。

 

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