想验证未知互做,有pulldown试剂盒,做质谱需要什么要求以及参数之类的呢？
在使用pull-down富集后进行质谱分析以验证未知蛋白互作时，需从样品准备、质谱采集参数到数据分析全流程考虑关键要点。以下是核心技术要求与建议参数，供参考：
一、样品准备（Pull-down后）
1. 蛋白含量要求
（1）通常建议每个样本输入不少于10–20 µg蛋白（银染可见为下限），对于DDA（Data Dependent Acquisition）质谱推荐50 µg以上更理想；
（2）若采用DIA（Data Independent Acquisition），则建议使用较高输入量或pooling样本提高定量准确性。
2. 非特异背景控制
（1）至少设置一个阴性对照组（如empty tag、IgG、beads only等），用于区分特异结合与背景；
（2）若pull-down为tag-based，建议与表达背景一致的“mock表达”作为对照。
3. 上样形式
（1）可提供in-solution消化产物（推荐）；
（2）或提供gel切条进行in-gel digestion（回收率略低）；
（3）必须彻底清除beads、盐、detergent（如SDS、Triton），建议使用正交洗脱缓冲液进行充分洗脱与清洗。
二、蛋白酶解与清洁
1. 推荐使用Trypsin单酶消化，酶解前加还原剂（DTT）和烷基化剂（IAA）；
2. 可酌情使用FASP、SP3或S-Trap等方式增强清洁性；
3. 酶解效率高、样本清洁将显著提升质谱信噪比和重复性。
三、质谱采集参数建议（视平台与模式）
常规DDA模式（如Orbitrap Exploris/Timstof等）：
| 参数 | 推荐设置 |
| MS1分辨率 | 60,000–120,000 |
| MS2分辨率 | ≥15,000 |
| 选择TopN | Top15–Top20（按平台优化） |
| 动态排除 | 30–60s，避免重复碎裂 |
| 质量窗口 | ±1.6 m/z |
| 扫描范围 | m/z 350–1600（可根据样本复杂度调整） |
若为DIA模式：
| 参数 | 推荐设置 |
| 扫描窗口 | 6–25 m/z 不等（视平台分辨率） |
| 总覆盖范围 | m/z 400–1200 或更广 |
| 建议采集参考库 | 可先跑DDA生成项目特异性library |
| 定量目标 | 相对定量互作蛋白丰度差异 |
四、数据分析建议
1. 鉴定：使用MaxQuant、Proteome Discoverer、Spectronaut等；
2. 定量：LFQ、iBAQ、或者DIA内建定量；
3. 筛选标准：
（1）log2 Fold Change ≥1 或 ≤−1；
（2）P值或FDR ≤0.05；
（3）去除在阴性对照中高丰度背景；
4. 注释分析：
（1）GO/KEGG注释；
（2）PPI网络（可对比STRING数据库）；
（3）亚细胞定位预测。
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