血浆外泌体RNA中低表达基因熔解曲线非单峰的解决方法有哪些呢？

一、从cDNA制备和预扩增角度优化

1、提高逆转录效率

使用逆转录效率更高、对低输入RNA更敏感的试剂（如SuperScript IV，或NEB LunaScript），推荐使用基因特异性引物逆转录以减少背景噪声。

 

2、引入预扩增步骤（preamplification）

若目标基因较多且每个反应体系RNA极低，建议在cDNA后加一个限圈数（10–14 cycles）预扩增步骤（Multiplex PCR），使用已验证特异性的引物池进行，扩增后再用于qPCR检测。这能在不增加RNA起始量的情况下显著提升目标基因信号强度，改善特异性。

 

二、引物设计与qPCR体系优化

1、重新优化引物设计（如果已有峰异常的引物问题集中于个别基因）

（1）熔解温度（Tm）需控制在60±2℃，避免过低。

（2）PCR产物控制在80–150 bp为宜。

（3）避免自聚/互补序列，务必使用引物设计工具（如Primer-BLAST，OligoAnalyzer）排查潜在二聚体、非特异性结合等。

 

2、优化qPCR体系与程序

（1）采用高保真酶或热启动酶（如Roche UPL、NEB Luna、Takara TB Green）提升反应特异性；

（2）调整退火温度略偏高（60–62℃）以压制弱结合；

（3）缩短退火延伸时间，有助减少非特异性扩增。

 

三、必要时使用探针法替代SYBR

如果特异性问题严重影响数据可用性且目标基因已明确可考虑使用TaqMan探针法替代SYBR Green检测，彻底避免非特异性产物干扰熔解曲线，不过这需重新设计实验流程且成本较高。

 

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