请问交联法蛋白相互作用分析的实验方法是怎样的？dss用的浓度是多少？

交联法（cross-linking）用于蛋白质相互作用分析时，核心思想是利用可与氨基酸侧链反应的双功能交联剂将相互作用的蛋白质共价固定，从而增强弱相互作用的稳定性，便于后续富集和鉴定。

 

一、实验方法简述（以DSS为例）

1、样本准备

可用细胞裂解液、纯化蛋白混合物或完整细胞（in vivo cross-linking），需保证体系中蛋白浓度适中（>1 mg/mL为佳）。

 

2、交联反应（使用DSS）

（1）DSS（Disuccinimidyl suberate）是常用的非可裂解型、胺反应型交联剂，反应目标是赖氨酸残基或蛋白质N端。

（2）溶解方式：DSS不溶于水，需新鲜溶于DMSO，避免吸潮降解。

（3）反应条件

• 终浓度：一般为 0.1–2 mM，常见起始浓度为 0.5 mM；
• 反应体系：使用无胺缓冲液（如PBS, HEPES），避免Tris等含胺基的缓冲液；
• 反应时间：室温 30 min 左右；
• 可通过梯度优化浓度（0.1, 0.5, 1 mM）和时间，避免过度交联导致非特异聚合。

 

3、终止反应

（1）加入Tris或氨基酸（如glycine）终止反应，终浓度20–50 mM；

（2）孵育10–15 min。

 

4、后处理

（1）可进行蛋白免疫沉淀、SDS-PAGE + Western blot，或进行酶解后LC-MS/MS进行交联肽段分析；

（2）若用于质谱，需配合交联肽富集策略与专业软件解析交联位点（如pLink, XlinkX等）。

 

二、浓度建议（针对DSS）

在蛋白裂解液中进行交联时，推荐的DSS终浓度一般为0.1至2 mM，可根据蛋白浓度和实验目的进行梯度优化。在纯化蛋白混合物中使用时，建议从较低浓度（如0.1至0.5 mM）起始以减少非特异交联的风险。若进行细胞内（in vivo）交联，通常需要更高的浓度，推荐范围为1至2 mM，同时需控制反应时间并尽快终止，避免对细胞造成过多毒性或诱导非生理状态的交联。整体上DSS浓度的选择需结合蛋白含量、样本复杂度及后续分析方式（如WB或LC-MS/MS）共同考虑。

 

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