想通过患者外周血找差异miRNA，请问该怎么处理样本呢？选择哪种测序方法呢？

通过患者外周血寻找差异miRNA是一项复杂的实验，需要从样本处理到测序方法的选择进行全面的规划。以下是详细的步骤和建议：

 

一、样本处理步骤

1、样本采集

（1）采血：从患者采集外周血（通常为静脉血），推荐使用含EDTA或柠檬酸钠抗凝剂的真空采血管。

（2）血浆分离：

• 在采血后1小时内完成血浆分离。
• 离心步骤：低速离心（~1500×g，10分钟，4℃），分离血浆；再次中速离心（~3000×g，15分钟，4℃）以去除细胞碎片和残余血小板。
• 将上清液分装至RNase-free的管中，立即放入-80℃保存。

 

2、RNA提取

（1）使用适合miRNA提取的试剂盒（如Qiagen miRNeasy Serum/Plasma Kit）。

（2）血浆中的miRNA浓度低，需加入载体RNA（如glycogen或线性丙烯酰胺）以提高回收率。

（3）使用的试剂和耗材需保持无RNA酶污染。

 

3、RNA质量和浓度检测

（1）质量检测

• miRNA通常不需要完整性（RIN值）的评价。
• 可使用Agilent Bioanalyzer 2100或类似设备，选择专用的Small RNA分析芯片。

（2）浓度测定

由于血浆中miRNA浓度极低，推荐使用Qubit miRNA Assay Kit进行精确测量。

 

二、测序方法选择

1、测序平台

目前用于miRNA测序的主流平台包括：

（1）Illumina平台（如NovaSeq、NextSeq）：适合大规模高通量测序，读长和数据质量高。

（2）MGI（BGI）测序平台：成本较低，也适合miRNA测序。

 

2、测序方法

推荐使用小RNA测序（Small RNA-Seq），其专门针对小片段RNA（如miRNA）进行高效检测：

（1）建库方法

• 使用专用的Small RNA建库试剂盒（如Illumina TruSeq Small RNA Library Prep Kit）。
• 建库过程中通过连接5'和3'特异接头捕获miRNA，并使用逆转录扩增获得文库。

（2）测序策略

• 单端测序（Single-end sequencing）。
• 推荐读长：50 bp。

（3）优点

• 能够全面分析已知和未知miRNA。
• 提供定量信息并发现差异表达。

 

三、数据分析

1、质量控制

使用FastQC或类似软件评估原始数据质量，去除低质量reads和接头序列。

 

2、miRNA比对与定量

（1）使用专门的miRNA分析软件或工具

• miRDeep2：预测和定量已知和新miRNA。
• Bowtie：用于短序列比对，结合miRBase数据库。

 

（2）参考数据库：miRBase。

 

3、差异表达分析

（1）使用DESeq2或edgeR进行差异表达分析。

（2）标准化数据以消除技术偏差。

 

4、功能分析

（1）使用工具（如TargetScan、miRDB）预测靶基因。

（2）结合KEGG和GO富集分析，探索差异miRNA的潜在功能。

 

四、补充注意事项

1、样本量设计

通常需要≥10例患者和≥10例对照组样本以获得具有统计学意义的结果。

 

2、质量控制

确保RNA提取、建库和测序过程中的无污染操作。

 

3、验证

差异miRNA的筛选结果需通过qPCR验证（如使用TaqMan miRNA Assays）。

 

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