如何分析蛋白–蛋白相互作用：实验技术指南

蛋白–蛋白相互作用（Protein–Protein Interactions, PPI）构成了细胞内几乎所有生命活动的基础。从信号转导、转录调控、蛋白降解，到免疫应答和肿瘤发生，蛋白–蛋白相互作用调控着分子网络的稳定与动态变化。近年来，随着结构生物学、质谱技术和高通量筛选方法的快速发展，研究蛋白相互作用已从常规的验证性实验，走向了系统性、网络化、精准化的研究方向。本文将从研究目的出发，系统梳理目前主流的PPI研究方法，涵盖低通量验证、高通量筛选及定量动力学评估。

一、蛋白–蛋白相互作用：生命网络的纽带

在细胞中，蛋白质以团队协作的方式执行功能，彼此之间通过特异性识别形成二聚体、多聚体或复合物。揭示蛋白–蛋白相互作用不仅有助于理解蛋白功能，还能发现潜在的疾病靶点和治疗策略。当前，多项系统生物学研究表明，复杂疾病的发生常常源于蛋白互作网络的紊乱，而非单个蛋白质的功能异常。因此，PPI研究不仅有助于解析生物学机制，更成为精准医学领域的重要研究方向。

从功能层面来看，蛋白–蛋白相互作用主要分为：

• 稳定型互作：形成长期存在的蛋白复合物，如核糖体、蛋白酶体等。
• 瞬时型互作：常出现在信号通路激活后，如激酶-底物结合、受体-配体结合等。

明确这些互作的类型，有助于选择合适的实验方法进行分析。

二、如何选择适合的PPI研究方法？

针对不同的研究目标，科学家需要从下列几个维度进行方法选择：

维度	内容	示例
研究目的	筛选新互作 or 验证已知互作	Y2H vs Co-IP
通量要求	高通量系统筛选 or 单个互作验证	AP-MS vs pull-down
生理相关性	体内 vs 体外	活细胞成像 vs 体外结合
定量需求	是否需要动力学参数	SPR、BLI等

        

三、主流蛋白–蛋白相互作用研究方法详解

1、酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）

Y2H 是最经典的PPI筛选技术，适用于全基因组尺度的互作筛查。其原理基于转录因子的功能重构，蛋白互作将激活报告基因表达。

适合场景：

• 探索未知互作网络
• 互作域（domain）映射
• 构建初步PPI网络

在多个模式生物中，Y2H已被用于构建全基因组蛋白–蛋白相互作用图谱，推动了功能基因组学的发展。

2、免疫共沉淀（Co-IP）

Co-IP 是研究已知或候选蛋白互作的“金标准”之一。通过使用特异性抗体沉淀目标蛋白及其结合伙伴，结合Western blot或质谱分析互作物组成。

3、拉下实验（Pull-down assay）

常用于体外研究互作机制。将融合标签的“诱饵蛋白”固定在亲和介质上，与游离“猎物蛋白”孵育后分析结合情况。

适用场景：

• 结构域映射
• 药物靶点确认
• 可定量比较不同突变体的结合能力

4、荧光互作技术（FRET、BiFC）

FRET 和 BiFC 允许在活细胞内观察蛋白–蛋白相互作用，具备时间和空间分辨率。

（1）FRET：测量两个荧光团之间的能量转移，反映距离变化

（2）BiFC：两个非活性荧光片段通过蛋白互作重新组装为可检测信号

5、交联质谱（XL-MS）

交联质谱通过化学交联剂“锁定”相互作用界面，随后进行酶解和质谱分析，可精确定位结合残基。

优势：

• 提供空间结构信息
• 可用于构建复合物三维模型
• 与冷冻电镜、AlphaFold 等协同使用效果显著

6、亲和纯化质谱（AP-MS）

结合免疫富集与高分辨率质谱，可以系统分析一个蛋白的“互作图谱”。特征：高通量，适用于复合物组装分析、信号通路重构

7、动力学分析：SPR 与 BLI

表面等离子体共振（SPR）与生物层干涉技术（BLI）是两种无标记实时检测蛋白结合的物理方法，适用于深入研究蛋白–蛋白相互作用的亲和力与结合动力学参数（如Kd、ka/kd）。在生物药研发过程中，SPR与BLI不仅用于蛋白–小分子互作，也被用于表征抗体与靶蛋白之间的蛋白–蛋白相互作用亲和力和稳定性。

四、多平台结合：构建互作图谱闭环

在实际科研项目中，建议通过以下组合策略获得更高可信度的蛋白–蛋白相互作用数据：

• Y2H 或AP-MS进行初筛
• Co-IP 或拉下实验验证互作
• FRET/BiFC 观察细胞内动态
• SPR/BLI 精准测定结合亲和力

在后基因组时代，科学研究不再止步于基因和单个蛋白的功能，而是转向网络系统的理解。蛋白–蛋白相互作用作为连接功能模块的桥梁，是解锁细胞调控奥秘的关键。依托先进的技术手段与专业的服务平台，研究者能够更准确地刻画生命过程的动态网络。百泰派克生物科技愿成为您可靠的科研伙伴，共同推进生命科学的前沿探索。

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