如何用AP-MS技术进行高通量蛋白互作检测？
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肿瘤信号通路互作组绘制
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表观修饰酶的复合物鉴定
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药物作用靶点的互作筛选
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干细胞命运调控网络分析
高通量蛋白互作检测是系统解析细胞信号通路、理解蛋白功能与生物网络机制的关键步骤。其中，亲和纯化质谱（Affinity Purification-Mass Spectrometry, AP-MS）作为目前蛋白互作研究中最可靠、最具生理相关性的技术之一，已经被广泛应用于哺乳动物细胞、模式生物、疾病模型等多种体系中。
一、什么是AP-MS？原理与优势解析
1、AP-MS技术原理
AP-MS是一种基于抗体识别或标签亲和纯化的方法，用于从复杂样本中富集目标蛋白（bait）及其互作伙伴（prey），随后通过质谱分析鉴定互作蛋白复合物。
基本流程如下：
（1）表达含标签的目标蛋白（如Flag、HA、Strep、BioTag等）；
（2）细胞裂解并进行亲和纯化，保留与目标蛋白形成复合物的互作蛋白；
（3）洗脱复合物并进行蛋白酶解（通常为胰蛋白酶）；
（4）使用LC-MS/MS进行质谱分析，鉴定肽段和蛋白质；
（5）生信分析过滤非特异性结合物，构建高置信度互作网络。
2、AP-MS相比传统方法的优势
（1）高特异性：通过标签或抗体纯化目标蛋白，显著减少背景信号；
（2）高通量：结合自动化平台与质谱，可以同时处理数百个样本；
（3）接近生理状态：在细胞内完成复合物组装，减少人工干预引起的假阳性；
（4）定量能力强：可引入标签定量（如TMT/iTRAQ）或标记自由定量（LFQ）策略。
二、如何设计一套高效的AP-MS互作检测实验？
1、目标蛋白（Bait）的选择与标签策略
选择目标蛋白应考虑其表达水平、结构特点、亚细胞定位等因素。标签的选择尤为关键，常见策略包括：
2、实验系统与蛋白表达方式
（1）对于低表达内源蛋白，建议使用过表达系统结合标签纯化；
（2）对于内源互作研究，推荐CRISPR knock-in标签保留天然调控机制；
（3）细胞模型的选择（HEK293、HeLa、肿瘤细胞系、干细胞等）需结合研究目的。
3、纯化体系优化
亲和纯化的核心在于最大程度保留真实互作，同时清除非特异性结合蛋白。关键参数包括：
（1）缓冲液组成：生理盐浓度/去污剂浓度（如NP-40、Triton X-100）影响复合物稳定性；
（2）洗脱方式：竞争洗脱 vs 酸洗脱 vs 酶切洗脱。
三、质谱分析策略：定性 + 定量 + 数据过滤
1、LC-MS/MS平台选择
（1）高分辨率质谱（如Orbitrap Exploris 480, QE HF-X）适合复杂样本分析；
（2）建议使用nanoLC-MS系统提高灵敏度，尤其适合低丰度互作蛋白检测。
2、定量策略：LFQ vs TMT
3、如何识别真互作 vs 非特异性背景？
（1）设置适当对照组（如空载体、非相关蛋白）；
（2）引入SAINT、MiST、CompPASS等算法计算互作置信度；
（3）结合CRAPome数据库过滤已知背景蛋白；
（4）使用生物学重复验证互作稳定性。
四、数据解读与互作网络构建
1、富集分析与网络可视化
（1）使用GO/KEGG通路分析预测互作复合物功能；
（2）构建PPI网络（如Cytoscape），识别关键Hub蛋白；
（3）联合其他组学（如转录组、磷酸化组）深化机制解析。
2、验证关键互作
（1）Co-IP、Western blot验证核心互作；
（2）使用CRISPR knockdown观察互作破坏后的功能变化；
（3）药物干预或突变体功能实验支持互作的生物学意义。
五、百泰派克生物科技在AP-MS领域的技术优势
作为国内领先的组学科研服务品牌，百泰派克生物科技在蛋白互作检测领域已完成数百例AP-MS项目，涵盖：
我们提供从实验设计 → 蛋白表达 → 亲和纯化 → 质谱分析 → 生信解读的一站式服务，助力客户高效开展蛋白互作研究。
使用AP-MS进行高通量蛋白互作检测，需要在实验设计、纯化策略、质谱平台、数据分析等多个环节进行精细优化。通过科学的流程与专业的技术支持，可以获得高可信度的蛋白互作网络图谱，深入揭示生命过程中的动态调控机制。如果您正在探索某一蛋白的互作网络、绘制信号通路图谱或寻找潜在药物靶点，欢迎咨询百泰派克生物科技，我们将以高标准的实验平台与专业的技术团队，为您的科研项目保驾护航。
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