蛋白质组学的定量方法有哪些？

定量蛋白质组学（Quantitative Proteomics），作为研究蛋白质表达变化和调控机制的核心手段，正快速演进出多种高分辨率、高灵敏度的策略。那么，有哪些蛋白定量方法？它们分别适用于哪些实验场景？该如何选择？接下来，我们将系统梳理当前主流蛋白质组定量技术，帮助科研人员在实验设计早期即构建合理方案，实现数据可重复、结果可信、差异明确的研究目标。

一、蛋白定量方法分类

蛋白质组定量方法大体可分为两类：

1、无标记定量（Label-Free Quantification, LFQ）

（1）不引入外源标签

（2）通过肽段的峰强度或谱图数量直接进行丰度推断

2、标记定量（Label-Based Quantification）

（1）通过代谢性或化学方式引入稳定同位素标签

（2）代表方法包括：

• SILAC（代谢标记）

• TMT、iTRAQ（同位素标签化学标记）

• Dimethyl（甲基化标记）

• AQUA、MRM、PRM（靶向标记/内标定量）

二、主流蛋白定量方法详解：原理 + 特点 + 应用场景

1、Label-Free Quantification（无标记定量）

（1）原理：

• 对不同样本分别进行酶解和质谱分析

• 比较相同肽段在不同样本中离子强度（Peak Area）或谱图数量（Spectral Count）来推断相对表达水平

（2）特点：

• 无需特殊试剂，成本低

• 样本数不受限制，扩展性强

• 适合复杂样本类型（组织、血清等）

• 受质谱稳定性影响较大，需批次间标准化处理

• 缺乏内参控制，难以避免系统偏差

（3）适用场景：

• 临床样本初步差异筛选

• 表达模式探索

• 可结合修饰组分析（如磷酸化组学）

2、SILAC（Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture）

（1）原理：

• 将含13C/15N的标记氨基酸（如13C6-Arg、13C6-Lys）添加至细胞培养基

• 经几代培养后，细胞合成蛋白全面“代谢标记”

• 将标记组和未标记组细胞混合后共同酶解、上机，降低实验偏差

（2）特点：

• 标记效率高，定量准确

• 样本混合处理，误差更小

• 适合动态变化分析（如蛋白合成/降解）

• 仅限于细胞系，不适用于动物或组织样本

• 培养周期较长，且成本高于LFQ

（3）适用场景：

• 药物作用时间梯度研究

• 蛋白翻译后修饰动力学分析

• 肿瘤细胞响应分析

3、TMT（Tandem Mass Tag）& iTRAQ（Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation）

（1）原理：

• 利用异重同质标签（isobaric tag）标记酶解后的肽段

• 各标签在MS1中表现为相同质量，在MS2中释放不同的报告离子（reporter ion）

• 通过比较reporter离子强度实现多组样本的相对定量

（2）特点：

• 可实现多样本并行处理（6~18个样本/批）

• 批间误差低，适合大规模实验设计

• 与Orbitrap等高分辨质谱平台兼容性好

• 比值压缩效应（ratio compression）可能影响定量精度

• 成本相对较高，标签价格昂贵

（3）适用场景：

• 疾病组与对照组蛋白差异筛查

• 多条件/多时间点实验设计

• 多组织/多重复生物样本定量

百泰派克生物科技支持 TMTpro 16plex，单次实验最多比较16组样本，大幅提高定量效率与通量。

4、Dimethyl Labeling（化学甲基化标记）

（1）原理：

• 利用甲醛（或重氢甲醛）与NaBH3CN对肽段N端和Lys残基进行甲基化标记

• 形成轻/中/重三种质量差异肽段，适合最多3组样本对比

（2）特点：

• 成本低，反应快速

• 标记效率高达95%以上

• 适合中小规模比较

• 通量受限，通道数少（通常≤3组）

• 样本混合前后对比可能产生偏差

（3）适用场景：

• 小规模蛋白表达差异分析

• 快速评估型实验

• 修饰肽定量

5、靶向定量技术：MRM/SRM、PRM、AQUA

（1）原理

MRM/SRM（多反应监测）

• 使用三重四极杆质谱

• 设定特定的“前体肽-碎片离子”对

• 适用于少量靶蛋白的高灵敏定量检测

PRM（平行反应监测）

• 使用Orbitrap类高分辨仪器

• 单前体肽触发全碎片扫描

• 保留MRM的特异性，兼具高分辨率和定量稳定性

AQUA（Absolute Quantification）

• 通过合成的稳定同位素标记标准肽与内源肽共分析

• 直接实现目标蛋白的绝对定量（fmol/ng）

（2）特点：

• 灵敏度极高，适合临床低丰度蛋白定量

• 数据高度可重复

• 常用于生物标志物验证阶段

• 不适合高通量筛选，目标肽设计门槛高

• 需精确标准品匹配与方法开发

（3）适用场景：

• 临床前/临床期标志物验证

• 多肽疫苗免疫学定量

• 药物动力学PK研究中的靶蛋白监测

三、不同蛋白定量方法的对比总结

方法	是否引入标记	可通量	灵敏度	重复性
LFQ	否	无限	中	中等
SILAC	是（代谢）	2–3	高	高
TMT/iTRAQ	是（化学）	6–18	高	高
Dimethyl	是（化学）	≤3	中	高
PRM/MRM	是（靶向）	1–30靶点	极高	极高

建议组合使用：TMT或LFQ进行全景定量筛选 → PRM验证关键蛋白 → 实现从探索到验证的闭环研究路径。

四、如何选择适合自己的蛋白定量方法？

选择合适的定量方法，不仅取决于实验预算，还应结合研究目标、样本类型、技术资源与验证路径：

决策因素	建议方案
样本类型复杂（血浆、组织）	LFQ或TMT较适配
细胞模型、追踪代谢变化	SILAC首选
组别数量多	优选TMT/iTRAQ（支持multiplex）
低丰度蛋白验证	选择PRM + 同位素内标（AQUA）
预算有限，但需稳定定量	Dimethyl或LFQ

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