免疫印迹怎么测定磷酸化的蛋白

    免疫印迹(Western blot,WB)是利用抗原抗体特异性结合的原理,基于SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白质分离、纯化以及相互作用研究的技术,也是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法。蛋白印迹技术先利用SDS-PAGE分离蛋白质样品,随后将电泳条带转移到固相载体膜上(如PVDF或尼龙膜),再利用磷酸化特异的抗体(一抗)来鉴定目的蛋白,能与磷酸化特异抗体结合的蛋白质即为磷酸化蛋白,最后通过标记的二抗识别一抗可以指示一抗的位置,即是待研究的磷酸化蛋白质的位置。

    免疫印迹法不适用放射性32P标记,避免了使用放射性同位素时的危险品和废物处理。此外,磷酸化抗体的灵敏性较强,可以轻松的检测常规细胞提取物中的磷酸化蛋白,对样品的用量要求不算严格。WB除了能定性检测磷酸化蛋白外,还能一定程度上评估磷酸化蛋白质的水平,由于受到不同实验处理和凝集上样误差的影响,通常先用一个抗体来检测同源蛋白的总水平(而不考虑磷酸化状态),以确定磷酸化组分相对于总组分的比例,并充当上样内对照。

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