质谱流式细胞术应用文章分析——药物研发

质谱流式细胞技术（CyTOF）是多参数单细胞分析技术之一，可应用于药物研发的各个阶段，包括优化药物筛选流程、发现新型标志物、筛选药物有效人群、实现用药后的免疫监测和预测等。

1、优化药物筛选流程

联合药物治疗有望通过靶向维持肿瘤进展的多种信号传导和调节途径来改善癌症治疗。随着FDA批准的潜在抗癌药物数量的增加，确定针对个体患者肿瘤量身定制的有效组合策略的可能性增加。已经提出了几种计算方法来识别最佳组合药物策略，这些策略依赖于基于高通量基因组和蛋白质组学测定重建肿瘤生物网络的方法。

2018年，斯坦福大学Sylvia K Plevritis团队在PNAS上发表了利用质谱流式技术进行药物筛选的研究。文章提供了一种正式的优化方法，称为药物嵌套效应模型（DRUG-NEM）来分析单细胞单药物筛选扰动数据，以确定解释肿瘤内异质性（ITH）的最佳药物组合。

DRUG-NEM模型首先需要确定与感兴趣的药物相关的所需的细胞内效应，并确定捕捉样本异质性的表面标志物。收集药物处理前后的单细胞数据，并用于量化各种药物的细胞内标志物的表达变化。为了处理这些数据，DRUG-NEM使用四个主要步骤。第一步，确定肿瘤内可能对药物扰动有不同反应的亚群，从而说明ITH的情况。第二步，DRUG-NEM计算药物效应，即药物Sj改变每个亚群k的细胞内标记物Mi的概率，并且这种效应与期望的反应有关，这些效应被加权以产生每个亚群中每个标记物的期望效应的概率。第三步，DRUG-NEM创建了一个药物嵌套效应模型（NEM），该模型使用一个图形模型，其中节点为药物，边定义共享或嵌套效应，说明了所有药物对所有亚群中每个标记物的影响。利用这个模型，DRUG-NEM的第四步是根据定义的评分函数对所有药物组合进行排名，以确定最小的药物组合，使单个肿瘤的预期细胞内效应最大化（图1）。

文章展示了DRUG-NEM在HeLa细胞上的表现，用四种不同药物（TNF相关凋亡配体（TRAIL）、MEK抑制剂、pP38MAPK抑制剂和磷酸肌苷3-激酶（PI3K）抑制剂）处理后进行质谱流式分析。DRUG-NEM确定TRAIL和MEK抑制剂为最佳药物组合。同时，文章也探究了DRUG-NEM在30个急性淋巴细胞白血病（ALL）原发患者中的应用，DRUG-NEM确定Das和Bez作为最佳的双药组合并且疗效得到了验证。

图1. 质谱流式细胞术DRUG-NEM实验流程

2、探究药物对免疫细胞表型影响

质谱流式技术还可以将信号检测与深度表型和其他功能检测进行复用，从而使研究人员能够对从血液或其他组织中分离出来的复杂的原始细胞混合物进行评估。随着治疗方法和靶点过渡到临床开发，这有望成为转化药理学工作的一个关键贡献。

他克莫司（FK506）和雷帕霉素（RAPA）广泛用于维持器官移植后的长期免疫抑制。但累积给药对接受者免疫系统的影响尚不清楚。2021年有研究报道了肾移植后3年FK506或RAPA治疗对人体免疫系统的影响。研究招募了30名患者，收集外周血，进行了29种金属同位素标记单克隆抗体组合的染色，获取免疫系统中T细胞网络的整体概况，并在 CD3/CD28 刺激下同时发生下游细胞内信号级联（图2）。

图2. 质谱流式细胞术他克莫司和雷帕霉素长期治疗患者的T细胞群深度表型分析

研究发现FK506和RAPA的慢性治疗所诱发的两种独特的T系抑制调节模式（图3）。在FK506组中，衰老的CD8CD57 T细胞亚群的百分比增加，T细胞受体（TCR）通路反应减少，表明移植的接受性更好。同时，调节性T细胞（Tregs）的百分比和CTLA-4的表达在RAPA组中都高达2倍，这表明当涉及到抗肿瘤或抗感染免疫反应时，FK506组和RAPA组的重新激活潜力不一致。此外，体外CD3/CD28刺激后T系磷酸化信号蛋白的上调表明RAPA组保留了更敏感的TCR信号传导途径。该结果在100名肾移植患者组成的独立验证队列被进一步验证，长期服用RAPA可以缓解长期摄入免疫抑制剂期间的肿瘤和感染的发展。

图3. 质谱流式细胞术聚类分析揭示了肾移植受者中抑制性T细胞亚群增加

3、药物作用机制探究

虽然流式细胞仪将继续用于化合物库中的定向筛选，但预计质谱仪将在阐明经过预筛选的潜在治疗效果的先导化合物的作用机制中发挥重要作用。例如，在筛选激酶抑制剂时，通过测量主要目标的动力学参数和同时测量抑制剂对其他激酶的非目标效应以及目标上下游的通路变化，质谱流式可用于更全面地阐明抑制剂的药理学。

AXL是Tyro3-AXL-Mer（TAM）受体酪氨酸激酶（RTKs）的成员，是一种很有希望肺癌治疗靶点。有研究设计了一个包含 21 种抗体的 CyTOF 组合识别AXL，SMAD4 / TGF-β和JAK1-STAT3信号通路，癌症干性和EMT的特征。CyTOF用于评估肿瘤内和肿瘤间的异质性以及基于以下因素的肿瘤亚群分层的AXL表达和信号网络作为潜在的定位策略（图4）。

图4. 质谱流式细胞术对肺部肿瘤和细胞系的致癌信号、癌症干性和上皮-间质转化（EMT）进行分析

CyTOF分析结果表明，对AXL的抑制抑制了SMAD4/TGF-β信号，并诱导了JAK1-STAT3信号以补偿AXL的损失。在治疗无效的肿瘤中，高JAK1-STAT3与AXL的水平增加有关。具有高AXL、TGF-β和JAK1信号的肿瘤同时显示出CD133介导的癌症干性和晚期患者的混合EMT特征，表明远处传播的潜力更大。从具有高AXL和JAK1的肿瘤中获得的患者衍生器官（PDO）对TP-0903和ruxolitinib（JAK抑制剂）治疗敏感。这项研究表明，对未接受治疗的肺部肿瘤进行单细胞质谱流式分析，再加上PDO的体外测试，可以在选定的肿瘤中发现连续的AXL、TGF-β和JAK1-STAT3信号激活，这些肿瘤可能是AXL-JAK1联合抑制的目标。

4、药物分布/药代动力学/药效学

药代动力学（PK）研究外部给予生物体的物质的命运，并深入了解药物如何在全身分布，但无法解释药物如何在细胞水平上起作用。药效学（PD）是研究一定药物浓度产生的生化和生理效应。然而，所涉及的微量化学物质所施加的技术限制了确定单个细胞在给药后如何受到特定药物影响的能力。随着单细胞检测和处理技术的快速发展，研究单细胞PK成为可能，尤其是在新型药物递送材料领域。

跟踪、检测和定量测量细胞和组织中纳米材料的能力推动了它们在生物医学中的日益普及。开发无标记、高分辨率和高维方法，同时可视化多种细胞类型的2D）材料，从而深入了解细胞功能和相互作用，以及它们在组织中的空间定位，对于将纳米材料转化为临床应用至关重要。有研究提出了一种基于质谱流式技术（CyTOF）和飞行时间离子束成像（MIBI-TOF）的多功能多重无标记单细胞检测策略。该策略“通过质质细胞术和MIBI-TOF设计对2D材料进行无标记sINgle细胞追踪”（LINKED），能够检测纳米材料并同时测量多个细胞和组织特征（图5）。

文章在70个原代人免疫细胞亚群中对此方法进行的检测和定量。与检测一起，质谱流式技术用于获取MXenes的几个生物学特征，例如它们的生物相容性和摄取后的细胞因子产生。通过酶标记，同时评估MXenes对细胞-细胞相互作用的介导。在小鼠中使用MXenes混合物的体内生物分布实验证实了检测策略的多功能性，并揭示了MXene在肝脏，血液，脾脏，肺和相关免疫细胞亚型中的积累。最后，将MIBI-TOF用于检测不同器官中的MXenes，揭示了这种材料的空间分布特征。

图5. 通过质谱流式细胞术和MIBI-TOF设计对2D材料进行无标记sINgle细胞追踪（LINKED）方法

外泌体作为细胞间的交流者和多功能的药物载体正在被广泛研究。这些外泌体的生物分布特征对于评估它们的生物功能和药物输送效果至关重要。然而，目前的外泌体追踪技术依赖于荧光，由于可用通道的数量有限和光谱溢出，其缺点是产量低。有研究报告了一种工程方法的发展，即把含有金属同位素的插层剂加载到外泌体中，在单细胞水平上对外泌体的吸收进行量化。质谱流式技术与高度多变量的细胞表型相结合，能够高通量地识别外泌体的体内命运。

文章使用质控细胞术来分析体内细胞对外泌体的摄取。首先用核酸插入剂DDP标记外泌体，然后静脉注射到小鼠体内。注射后13小时，分离肝脏、脾脏和股骨。用13种同位素标记的抗体对13种表面标志物进行单细胞染色，并使用质谱细胞术进行分析。结果表明通过质谱流式技术在单细胞水平上成功检测了外泌体摄取，并且巨噬细胞和非免疫细胞（包括肝实质细胞、血管细胞和基质细胞）比其他免疫细胞吸收更多的外泌体（图6）。

图6. 质谱流式细胞术分析外泌体摄取的单细胞

5、药效评估/患者选择

癌症免疫疗法为有反应的患者提供了生存益处，但许多患者没有反应。确定治疗反应是优化药物选择和改善患者预后的首要任务。有研究对158例接受抗PD-1单药治疗（n = 63）或联合抗PD-1和抗CTLA-4治疗（n = 57）的黑色素瘤患者的肿瘤活检进行了转录组学和质谱流式分析。这些数据确定了两种治疗方法的应答者的活化T细胞特征和T细胞群。进一步的质谱流式分析确定了一种EOMES、CD69、CD45RO效应记忆T细胞表型，与非应答者（n = 18）相比，该表型在联合免疫疗法的应答者中明显更为丰富（图7）。该研究确定对单药抗PD-1和联合抗CTLA-4和抗PD-1免疫疗法的反应和耐药的生物学，以更好地选择此类治疗的患者，并确定耐药患者的治疗操作的替代途径。

图7. 质谱流式细胞术揭示不同的免疫细胞群决定了对抗PD-1单药治疗和抗PD-1/抗CTLA-4联合治疗的反应

CD19导向的嵌合抗原受体修饰（CAR T）T细胞在大约30%至40%的复发/难治性大B细胞淋巴瘤中获得持久缓解。T细胞衰竭和/或免疫抑制性肿瘤微环境可能导致CAR T细胞失败。Pembrolizumab是一种抗PD1免疫检查点抑制剂，可在CAR T细胞治疗后逆转T细胞衰竭。有研究通过质谱流式技术（CyTOF）检测联合Pembrolizumab治疗后CAR T细胞的变化。质谱流式数据表明CAR T细胞的百分比增加，且临床反应者的CAR T细胞激活和增殖增加，T细胞衰竭减少。该文章结果表明在CD19导向的CAR T细胞治疗后用pembrolizumab阻断PD1似乎是安全的，并可能在一些对CAR T细胞治疗难治或复发的B细胞淋巴瘤患者中获得临床反应（图8）。

图8. 质谱流式细胞术检测帕博利珠单抗联合CD19导向CAR T细胞治疗的实验设计

质谱流式技术（Mass Cytometry）在药物开发和生物制品表征中的潜力巨大。质谱流式细胞术将质谱技术与流式细胞仪相结合，能够实现对单个细胞的生化成分进行深入研究，帮助我们理解疾病机制，验证药物的效果，发现新的药物靶点以及增强生物制药质量控制。这在生物制品表征中非常有用，它可以帮助解决以下一些问题：

单细胞层次的分子表征：传统的质谱技术通常需要大量的样本以获取可靠的结果，而质谱流式技术则可以分析单个细胞的生化成分，这可以帮助我们更深入地理解细胞的生物学特性。

生物分子的定量分析：质谱流式技术可以对细胞内的生物分子进行定量分析，包括蛋白质、代谢物和其他生物分子。

细胞异质性的研究：细胞群体中的细胞并非完全相同，它们之间的差异可能影响疾病的发展和治疗的效果。质谱流式技术可以帮助我们研究这种细胞异质性。