药物开发和生物药物表征:质谱流式应用文章分析——神经免疫
免疫细胞包括多样化的细胞亚群,它们通过细胞因子介导的互作和直接的细胞-细胞相互作用,与其他免疫和非免疫细胞协同行使生物学功能。大脑由影响大脑发育、组织平衡和神经元活动的常驻和浸润免疫细胞组成。中枢神经系统(CNS)紊乱会引发广泛的疾病,包括情绪障碍、脑血管疾病、多动症和自闭症等神经发育疾病,焦虑抑郁、精神错乱、成瘾等精神类疾病,阿尔茨海默(AD)、帕金森(PD)、亨廷顿病(HD)等神经退行性疾病。而这些严重危害人类健康,造成沉重的社会负担。越来越多的证据表明,免疫系统在中枢神经系统发育和功能中的作用(图1)。因此,免疫调节作为治疗中枢神经系统紊乱疾病的一种治疗策略,已经得到越来越多的关注。
图1. 质谱流式细胞术分析免疫系统在中枢神经系统的作用
质谱流式技术可以对复杂的免疫网络中的其单个细胞成分进行描述,该技术的出现使得对大脑的高维分析成为可能,从而使人们对神经-免疫相互作用的理解达到新的水平。
一、组织表征
2017年,来自以色列理工学院的Asya Rolls团队使用44个细胞表面标记来表征幼稚小鼠大脑的免疫群体,以绘制大脑免疫区室的高维单细胞表征。文章确定了大脑区室中的各种免疫细胞亚群,表征了这些细胞亚群的独特特征,并将其组成与外周血中的组成进行了比较。这种广泛的分析能够揭示以前未表征的浸润免疫群体,证明常驻髓细胞和浸润细胞的表型的范围和丰富性,并将CD44鉴定为区分幼稚大脑内常驻免疫细胞和浸润免疫细胞的标志物。2018年,该团队在Nature Protocol上发表了对脑中免疫细胞的质谱流式分析流程。文章提供了一个分步骤的描述,介绍了分析小鼠脑区的质谱流式实验方法。该程序的不同阶段包括脑灌注、提取脑组织并将其分离成单细胞悬液,然后用金属标记的抗体进行细胞染色,用质谱仪读取样品,用SPADE和viSNE进行数据分析。这个过程需要<5小时(不包括数据分析),可用于研究正常和病理条件下大脑免疫群体的变化(图2)。
图2. 使用质谱流式细胞术分析脑室的实验示意图
中枢神经系统(CNS)包含多种免疫细胞类型,在组织稳态、免疫防御和神经系统疾病中具有不同的作用。绘制整个大脑的白细胞图一直是个挑战,特别是在病理学中,表型变化和血源细胞的涌入阻碍了对反应性白细胞群的明确区分。有研究应用高维单细胞质量和荧光细胞仪,与遗传命运图谱系统并行,来识别、定位和描述哺乳动物中枢神经系统内多个不同的免疫群体。使用这种方法,文章发现小胶质细胞、边界相关巨噬细胞的几个亚群和树突状细胞在稳定状态下共存于中枢神经系统,并在衰老过程中以及在阿尔茨海默病和多发性硬化症模型中表现出疾病特定的转变(图3)。
图3. 质谱流式细胞术可识别稳态中枢神经系统相关细胞多样性
小胶质细胞是中枢神经系统的常驻先天免疫细胞,在维持中枢神经系统完整性和功能方面具有重要作用。它们参与去除凋亡神经元,完善突触连接并为记忆和运动学习提供营养支持。有研究通过质谱流式技术测定人小胶质细胞区域异质性和表型。该研究使用两个不同的抗体组合(35个抗体/组合)对样本进行染色。A组旨在检测主要的循环免疫细胞亚群(T和B细胞,单核细胞,自然杀伤(NK)细胞)和小胶质细胞,使用增殖标志物,活性相关标志物,趋化因子受体和细胞亚群标志物,包括P2Y12,IRF4,IRF8,CD45,CD3,CD62L,CD19,HLA-DR,CD56,cyclin A&B1以及Ki-67。B组旨在使用35种抗体分析小胶质细胞和先天免疫细胞亚群的表型,包括TMEM119,CD172a,CD279(PD-1),CD274(PD-L1),arginase-1,CCR7,CD44,CD18和CD32(图4)。文章对来自不同大脑区域的小胶质细胞进行了大规模的单细胞免疫分析,确定了小胶质细胞的表型特征。
图4. 人脑小胶质细胞的质谱流式分析
二、神经发育过程
人类神经系统发育的主要程序包括诱导及原始神经胚形成(发生高峰于妊娠3~4周)、前脑发育(发生高峰于妊娠2~3个月)、神经细胞增殖、移行与分化(发生高峰于妊娠3~5个月)突触连结及神经回路建立、树突发芽、膜兴奋性形成的发生高峰于妊娠5个月至出生后数年;神经髓鞘化的发生高峰在出生至出生后8个月左右。利用模式动物阐明神经发育生物学中存在的基础性关键问题是现代生命科学研究的重要任务。
位于背根神经节 (DRG) 中的躯体感觉神经元将各种感觉刺激传递到中枢神经系统 (CNS),包括机械压力、肢体位置变化、温度、疼痛和瘙痒。有研究开发了一个41抗体组合,包括关键转录因子,神经营养因子受体和其他已知在DRG细胞类型的规范和成熟中起关键作用的蛋白质标志物用于研究背根神经节的发育。
图5.质谱流式细胞术用于分析背根神经节发育
该研究对C57/BL6小鼠的背根神经节进行了单细胞质谱流式分析,鉴定并量化了DRG中胚胎和出生后发育中30种分子不同的体感神经胶质细胞和41种躯体感觉神经元亚型的丰度。对分化轨迹的分析显示,罕见的细胞共同表达两个或更多的Trk受体,并过度表达干细胞标志物,这表明这些神经营养因子受体在细胞命运规范中发挥了作用(图5)。
三、神经相关疾病
脑部恶性肿瘤可以起源于中枢神经系统(胶质瘤)或从身体的其他位置侵入(转移),高度免疫抑制的肿瘤微环境(TME)影响着脑瘤的生长。TME主要是由中枢神经系统微环境还是由恶性肿瘤本身形成,以及中枢神经系统肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的多样性、起源和功能都是未知的。因此,有研究组利用质谱流式技术绘制了脑瘤的免疫细胞图谱(图6)。
图6.质谱流式细胞术揭示了脑瘤免疫细胞图谱
研究首先获得38名接受神经外科手术的患者身上采集新鲜切除的组织,设计了两个CyTOF抗体组合,在单细胞水平上测量了74个参数。第一个抗体组合以髓细胞为重点,以捕获大脑TME中的整个吞噬细胞谱,以及谱系识别标记物,以绘制主要的白细胞群及其相对细胞频率。第二个抗体组合以淋巴细胞为重点,旨在深入探究淋巴细胞亚群分布(图7)。结果表明TME内组织驻留和入侵的免疫细胞的异质性组成,就可以明确区分胶质瘤和脑转移瘤(BrM)。胶质瘤TME主要表现为组织驻留的反应性小胶质细胞。组织侵入的TAMs显示出独特的特征轨迹,揭示了其对肿瘤的影响以及对淋巴细胞激活的调控。
图7. 质谱流式细胞术抗体组合(部分)
进一步,有研究组利用质谱流式成像技术表征来自患者的 139 例高级别胶质瘤和 46 例脑转移肿瘤的免疫学景观。该研究对高维组织病理学图像中的 1多万个细胞进行单细胞分析,实现了免疫谱系和激活状态的空间分辨率,揭示了原发性肿瘤和各种实体癌脑转移瘤之间免疫景观的差异(图8)。
图8. 质谱流式成像揭示大脑TME内的细胞动力学
有研究使用单细胞质谱细胞术揭示小鼠神经炎症和神经变性模型中不同的脑髓细胞群。该研究使用39个抗体进行染色,比较了多发性硬化症的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型、亨廷顿病(HD)的R6/2模型和肌萎缩侧索硬化症(ALS)的突变体超氧化物歧化酶1(mSOD1)模型中的髓细胞群的变化,确定了三种专属于中枢神经系统的骨髓细胞群,并存在于每个疾病模型中(图9)。
图9. 质谱流式细胞术实验流程示意图
先天性和适应性免疫在帕金森病(PD)中起着至关重要的作用。然而,关于PD外周血中特异性免疫细胞分类的研究仍然缺乏。有研究使用质谱细胞术染色技术对不同发病年龄帕金森病患者外周血中的细胞群进行准确的免疫分型。文章表征了60个细胞簇,发现PD的免疫特征变化,包括效应CD8 T细胞减少,细胞毒性自然杀伤(NK)细胞降低和PD患者活化单核细胞增加(图10)。
图10. 质谱流式细胞术揭示不同发病年龄帕金森病的特异性免疫状态
阿尔茨海默病是一种无法治愈的神经退行性疾病,神经炎症在其中起着关键作用。然而人们对适应性免疫反应在阿尔茨海默病中的贡献知之甚少。因此,有研究利用对多个队列的综合分析,确定了阿尔茨海默病的外周和中枢适应性免疫变化。该研究对外周血单核细胞进行了质谱流式分析,发现了阿尔茨海默病的免疫特征,包括CD8 T效应记忆CD45RA(TEMRA)细胞的数量增加。在第二个队列中,我们发现CD8+ TEMRA细胞与认知能力呈负相关。这些结果揭示了阿尔茨海默病患者血液和脑脊液中的适应性免疫反应(图11)。
图11.质谱流式细胞术揭示 AD患者外周 CD8+TERAM细胞增加,与认知呈负相关
四、疾病治疗
胶质母细胞瘤 (GBM) 对免疫检查点抑制剂 (ICI) 治疗无效,有研究使用CyTOF质谱细胞术来比较通常为ICI难治性(GBM和肉瘤)或ICI反应性(肾细胞癌)的人类肿瘤的肿瘤免疫微环境(TIME)。文章使用2个含有42个抗体的组合对样本进行染色,发现人类和小鼠肿瘤中的ICI敏感性与T细胞和树突状细胞(DC)增加以及骨髓细胞减少有关,特别是PD-L1 +肿瘤相关巨噬细胞(图12)。
图12. 质谱流式细胞术揭示ICI难治性GBM与丰富的PD-L1+肿瘤相关巨噬细胞和不良的T细胞浸润有关
为了深入了解肿瘤特异性免疫调节目标,有研究分析了代表五种不同癌症类型的94名患者,包括那些对免疫检查点疗法反应相对较好的患者和那些没有反应的患者。该研究通过质谱流式技术和单细胞RNA测序,在多形性胶质母细胞瘤中发现了一个独特的CD73hi巨噬细胞群体,在抗PD-1治疗后仍然存在。并通过一系列动物实验,将CD73确定为特异性免疫治疗靶点,以改善多形性胶质母细胞瘤对免疫检查点治疗的抗肿瘤免疫应答(图13)。
图13. 质谱流式细胞术鉴定肿瘤浸润免疫细胞亚型
质谱流式技术(Mass Cytometry)在药物开发和生物制品表征中的潜力巨大。质谱流式细胞术将质谱技术与流式细胞仪相结合,能够实现对单个细胞的生化成分进行深入研究,帮助我们理解疾病机制,验证药物的效果,发现新的药物靶点以及增强生物制药质量控制。这在生物制品表征中非常有用,它可以帮助解决以下一些问题:
单细胞层次的分子表征:传统的质谱技术通常需要大量的样本以获取可靠的结果,而质谱流式技术则可以分析单个细胞的生化成分,这可以帮助我们更深入地理解细胞的生物学特性。
生物分子的定量分析:质谱流式技术可以对细胞内的生物分子进行定量分析,包括蛋白质、代谢物和其他生物分子。
细胞异质性的研究:细胞群体中的细胞并非完全相同,它们之间的差异可能影响疾病的发展和治疗的效果。质谱流式技术可以帮助我们研究这种细胞异质性。
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