药物开发和生物药物表征：质谱流式细胞术应用文章分析——癌症
癌症是全球范围内人类的主要死亡原因之一。在过去 30 年中，识别驱动基因修饰一直是癌症研究的核心目标，从而产生了癌症基因组图谱 （TCGA）和癌症体细胞突变目录 （COSMIC） 等，其中包括广泛的大规模、系统测序研究，这些研究构成了主要肿瘤类型突变异常的综合目录。
近年来，对于癌症的研究开始关注肿瘤-免疫过程（图1），尤其是肿瘤微环境（TME）中的免疫状态。免疫细胞异质性和各种细胞亚群的存在使TME免疫分析复杂化。此外，肿瘤团块内免疫的空间分布是显着影响免疫细胞获得促肿瘤或抗肿瘤功能的关键参数。考虑基因组学、转录组学、表观基因组学和蛋白质组学的多组学观点对于揭示TME的免疫复杂性是必要的。
图1. 质谱流式细胞术癌症免疫周期
肿瘤和免疫系统这两个交织系统相互作用的内在复杂性带来了相当大的挑战，需要全面的方法来检测肿瘤起始和进展期间以及治疗调节后的癌症免疫。几种已建立的新型高通量技术能够生成必要的数据，从而为机制理解提供基础，并最终增加受益于癌症免疫治疗的患者数量。二代测序（NGS）技术不仅提供了可以挖掘免疫相关参数的大型数据集。但也越来越多地用于临床环境，为癌症治疗提供信息。此外，单细胞RNA测序（scRNA-seq）和质谱流式技术（CyTOF）等新技术已经成熟，并首次能够在单细胞水平上精确表征分子过程。质谱流式技术已经在肿瘤的早期检测，免疫图谱绘制等多个领域被应用。
1、肿瘤的早期检测和复发预测
恶性肿瘤其特征是起病隐匿，导致诊断和治疗延迟。目前临床使用的常规血清学检测因其敏感性低或特异性低而受到限制。因此需要拓展于肿瘤筛查，早期检测和预测复发的新型工具。
2023年，浙江大学医学院附属第一医院团队在Gut上发表了基于质谱流式技术的外周血分析作为早期检测实体瘤的新工具。文章对来自15个中心的2348名参与者进行了CyTOF分析，包括1131名肝病患者，584名胰腺疾病患者和633名健康志愿者。通过外周血的CyTOF分析确定了由肝细胞癌（HCC）或胰腺导管腺癌（PDAC）引起的人类外周免疫细胞亚群的改变（图2）。
图2. 质谱流式细胞术肿瘤患者外周免疫状态概况
文章采用随机森林算法分别从HCC和PDAC的训练组中发现结果特征。在肝脏组中确定了7个标志物和16个细胞亚群，有可能将HCC与非HCC受试者区分开来）。在胰腺组中获得了8个标记物和11个细胞亚群用于PDAC筛选。这些细胞亚群包含单核细胞、B细胞和T细胞。然后将这些标记和细胞亚群应用于构建诊断模型。基于iPBIScore的模型显示，与其他肝良性疾病的HCC分化AUC值为0.97，PDAC与其他胰腺良性疾病的分化AUC值为0.92。
同时，文章也研究了肿瘤患者中的潜在亚型。分析重要的临床病理学参数，如肿瘤标志物、肿瘤分化程度和疾病分期。我们对基于PBIScore的模型中包含的细胞亚群进行了重新聚类，并比较了它们在这些临床病理学参数中的比例。确定了原发肿瘤和外周免疫状态之间免疫细胞亚群的相关性，并定义了可能对外周免疫失衡有重要影响的一些细胞亚群（图3）。
图3. 质谱流式细胞术用于模型构建的细胞亚群与肿瘤特征之间的关系
除了肿瘤早期检测，质谱流式技术也可以用于预测肿瘤的复发。2022年，浙江大学医学院附属第一人民医院团队发表了基于质谱细胞术的不同免疫谱预测肝移植患者肿瘤复发的研究结果。质谱流式技术用于揭示肝移植（LT）后外周免疫系统的动态变化。在49个时间点从12名肝移植接受者那里收集了5份血液样本：手术前（BS），肝移植后3天（D-3），肝移植后1周（W-1），肝移植后2周（W-2）和肝移植后3周（W-3）。从收集的样品中提取含有超过3万个CD45细胞的PBMC，并使用具有42个标记物的定制设计的抗体组合进行CyTOF分析（图4）。
图4. 质谱流式细胞术肝移植受者的外周血单细胞（PBMC）的免疫分型实验流程
CyTOF分析显示，在LT后3周，活化的免疫细胞群增加，而具有抑制功能的免疫细胞（髓源性抑制细胞）的比例减少。肝细胞癌LT患者的LT后免疫组成与肝细胞癌以外病因的LT患者有很大不同。此外，在LT后3周，与未复发的患者相比，肝细胞复发患者的两个T细胞亚群：CD57 HLA-DR CD8和CD28γδ。CD57 HLA-DR CD8 T细胞表现出高水平的穿孔素、颗粒酶B和Ki-67，并显示出高度细胞毒性和增殖性表型，而CD28γδ T细胞的IFN-γ水平降低，因此与CD28细胞相比，激活程度较低（图5）。
图5. 质谱流式细胞术对CD57 HLA-DR CD8 T细胞和CD28γδ T细胞进行功能评估
基于这些发现，文章得出结论通过CyTOF分析LT受体的PBMC可以预测LT后HCC复发。独特的免疫特征可在 LT后3周对有肝细胞癌复发风险的患者进行分层，这将有助于临床医生制定进一步的管理计划并改善患者的预后。
2、肿瘤免疫图谱
肿瘤免疫微环境（TME）是一个复杂的生态系统，由各种细胞类型，其分泌产物（例如细胞因子，趋化因子）以及细胞外基质（ECM）的其他非细胞成分组成。单细胞转录组学在TME研究中的应用已经对TME的细胞和分子复杂性产生了前所未有的分辨率，加速了对TME内不同细胞类型之间的异质性，可塑性和复杂交叉相互作用的理解（图6）。而质谱流式技术的出现可以从蛋白层面表征肿瘤免疫状态，透明细胞肾细胞癌，肺腺癌，乳腺癌，结直肠癌，肝癌等多种癌症的肿瘤免疫图谱已被报道。
图6. 质谱流式细胞术肿瘤微环境（TME）多组学分析的主要方法概述
2017年在Cell上同时发表了两篇论文开启了基于质谱流式技术绘制肿瘤免疫图谱的热潮。Bernd Bodenmiller团队使用质谱流式技术对73名透明细胞肾细胞癌（ccRCC）患者和3名健康对照的样本进行了深入的免疫分析（图7）。在5万个测量细胞中鉴定了17种肿瘤相关巨噬细胞表型、22种T细胞表型以及与无进展生存相关的独特免疫组成，从而提供了该疾病免疫肿瘤微环境的深入人类图谱（图7）。这项研究揭示了免疫疗法开发的潜在生物标志物和靶点，以及可用于其他肿瘤类型免疫分析的经过验证的工具。
图7. 质谱流式细胞术表征ccRCC TME中的T细胞和TAM的实验设计
Miriam Merad团队使用质谱流式技术检测了32名患者的肿瘤组织，包括肿瘤组织，正常肺组织和血液，提供早期肺部肿瘤的详细免疫细胞图谱（图8）。研究表明，I期肺腺癌病变已经具有显着改变的T细胞和NK细胞区室。确定了可能损害抗肿瘤T细胞免疫的肿瘤浸润性骨髓细胞（TIM）亚群的变化。
图8. 质谱流式细胞术单细胞分析的早期肺腺癌的先天免疫景观
研究发现在疾病的I期，肺腺癌病变的CD8+效应T细胞/Treg比率与正常肺组织相比强烈降低。这种T细胞比例的改变是由于表达颗粒酶B和IFNγ的CD8+T细胞明显减少，肿瘤部位的CD39hiCD38hiPD-1hiCTLA4hiFoxp3hi Tregs明显扩大。不同的TIL肿瘤特征伴随着肿瘤CD16+ NK细胞的显着改变，因为它们在肿瘤中强烈减少，并且与肺NK细胞相比，剩余的少数NK细胞表达的颗粒酶B水平较低，IFNγ较少。在不同的TNM阶段，居住在肺腺癌肿瘤病灶中的所有抗原呈递细胞亚群都有明显的变化。具体来说，I期肺腺癌病变中的CD141+DC明显减少，而PPARγhi巨噬细胞富集。配对单细胞分析为肿瘤驱动的免疫变化提供了有价值的知识，为免疫疗法的合理设计提供了强有力的工具。
3、肿瘤细胞异质性图谱
除了肿瘤中的免疫细胞，质谱流式也可以通过相关指标设置来检测肿瘤细胞的异质性。
2021年，斯坦福大学Wendy J Fantl团队对22例高级别浆液性卵巢肿瘤（HGSOC）样本的肿瘤进行分解，取超过800，000个活的单细胞进行质谱流式分析（图9）。应用多参数CyTOF在单细胞水平上解剖HGSOC，目的是鉴定与肿瘤发展和耐药性有关的临床相关细胞亚群，并有可能提供新的治疗靶点。
图9. 质谱流式细胞术高级别浆液性卵巢肿瘤异质性实验设计
与免疫细胞表型指标不同，该研究设计41种抗体的组合，其中包括4种抗体，允许对活肿瘤细胞进行手动设门，其余37种用于描述HGSOC肿瘤生物学特征，其中使用CD45、FAP和CD31的手动设门分别从分析中排除免疫细胞、基质细胞和血管细胞。cPARP抗体用于筛选出非活肿瘤细胞（图10）。
图10. 用于质谱流式细胞术分析的抗体指标
文章使用CyTOF抗体小组询问HGSOC生物学的特征，结合无监督的计算分析，我们确定了在整个肿瘤中共同出现的值得注意的细胞类型。除了一个主要的细胞亚群外，每个肿瘤都有比较罕见的细胞表型。其中一个组别共同表达E-cadherin和vimentin（EV），表明它们在上皮间质转化中的潜在作用，这被成对的相关分析所证实。此外，结果较差的患者的肿瘤有另一种罕见的细胞类型，即共同表达波形蛋白、HE4和cMyc的频率增加。尽管该疾病的基因组复杂性已得到认可，但这里发现的特定细胞表型为治疗干预和疾病监测提供了数据支持。
也有文章报道使用质谱流式技术研究了NSCLC细胞系和原发性肺腺癌的异质性。以单细胞分辨率研究了人NSCLC腺癌细胞A549、H1975和H1650的13种标志物的表达模式：GLUT1、MCT4、CA9、TMEM45A、CD66、CD274、CD24、CD326、泛角蛋白、TRA-1-60、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-1和EGFR（图11）。研究发现GLUT1，MCT4，CA9，TMEM45A和CD66的高表达与肿瘤组织相关。
图11. 使用质谱流式细胞术分析A549，H1975和H1650人NSCLC细胞的细胞系内异质性
4、肿瘤患者治疗效果监测
免疫检查点封锁彻底改变了癌症治疗。特别是，已发现抑制程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）可有效治疗转移性黑色素瘤和其他癌症。但依然有很大一部分患者没有表现出持久的缓解，因此，迫切需要临床反应的预测性生物标志物。
Burkhard Becher团队使用转移性黑色素瘤患者在治疗前和治疗期间的外周血单核细胞（PBMC）作为一种易于获得的微创活检来探测与抗PD-1免疫治疗反应相关的免疫特征。文章使用质谱流式技术对IV期黑色素瘤患者在接受12周抗PD-1免疫治疗前后的外周血中的免疫细胞亚群进行了深入分析。研究发现，在开始治疗之前CD4和CD8 T细胞的淋巴细胞减少，γδ T细胞和NKT细胞的轻微升高，对抗PD-1免疫治疗的无进展和总生存率的有力预测是CD14CD16+-HLA-DRhi单核细胞的频率。在治疗前，应答者与非应答者相比，表达IL-4、Grz-B、IFN-γ或GM-CSF的CD4 T细胞以及表达CTLA-4、Grz-B或IL-13的CD8 T细胞的频率略有增加。然而，在治疗开始后，应答者中表达PD-1、IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-17A和Grz-B的CD4 T细胞数量高于非应答者。对于CD8 T细胞，与非应答者相比，在应答者中检测到CTLA-4和颗粒酶B的上调（图12）。
图12. 使用质谱流式细胞术鉴定对PD-1疗法有/无应答患者的免疫细胞群的差异
除了免疫治疗，质谱流式也可以在监测其他疗法的效果。有研究使用质谱流式技术监测了急性和慢性剂量标准细胞毒化疗后晚期CRC患者的循环免疫细胞谱，并分析了7个主要的免疫细胞群和20多个亚群。对质谱数据的无监督聚类分析显示，在一个周期的细胞毒化疗后，NK细胞的数量减少。对NK亚群的调查显示，在急性和慢性化疗后，CD56dim CD16 NK细胞群下降。进一步分析长期化疗期间NK细胞亚群的频率，发现亚群发生了变化，成熟的、具有细胞毒性的CD56+dim CD16减少，同时不太成熟的CD56+dim CD16-和CD56bright NK细胞群显著增加。此外，对NK细胞中信号反应的磷酸化状态的分析发现，患者和健康志愿者之间的pERK、pP38、pSTAT3和pSTAT5存在明显差异，并且在整个化疗过程中保持不变（图13）。
图13. 质谱流式细胞术结果表明急性化疗后CRC患者的NK细胞数量下降
5、肿瘤患者耐药机制探究
质谱流式也可以用于探究癌症的非遗传耐药机制。早在2014年，就有一篇综述提到“质谱细胞术是一种基于流动的技术，可在单细胞中同时测量多达50种蛋白质的活化，现在能够在功能水平上逐个细胞检查非遗传抗性。质谱细胞术的应用与新的生物信息学技术相结合，将解决有关非遗传耐药性的基本问题：耐药性是由选择具有预先存在的生存表型的细胞还是诱导生存计划引起的？哪些生存途径是非遗传抗性所必需的，它们如何相互作用”。
有研究开发了对紫杉醇和多柔比星有抗性的IBC细胞系，并对其进行了表征，以模拟患者的治疗抗性。通过CyTOF和单细胞RNA-seq对化疗期间单细胞水平的细胞动态和异质性进行调查，确定了耐药性的机制，包括通过选择罕见的预先存在的亚群或获得性变化，从腔内细胞状态转变为基底/间质细胞（图14）。这些结果为化疗与抑制JAK2/STAT3信号的联合治疗作为IBC的一种更有效的治疗策略提供了机制上的合理性。
图14. 质谱流式细胞术数据展示抗性发展中的细胞异质性和动态
质谱流式技术（Mass Cytometry）在药物开发和生物制品表征中的潜力巨大。质谱流式细胞术将质谱技术与流式细胞仪相结合，能够实现对单个细胞的生化成分进行深入研究，帮助我们理解疾病机制，验证药物的效果，发现新的药物靶点以及增强生物制药质量控制。这在生物制品表征中非常有用，它可以帮助解决以下一些问题：
单细胞层次的分子表征：传统的质谱技术通常需要大量的样本以获取可靠的结果，而质谱流式技术则可以分析单个细胞的生化成分，这可以帮助我们更深入地理解细胞的生物学特性。
生物分子的定量分析：质谱流式技术可以对细胞内的生物分子进行定量分析，包括蛋白质、代谢物和其他生物分子。
细胞异质性的研究：细胞群体中的细胞并非完全相同，它们之间的差异可能影响疾病的发展和治疗的效果。质谱流式技术可以帮助我们研究这种细胞异质性。
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