药物开发和生物制品表征:质谱流式实验技术流程——样本染色-百泰派克生物科技BTP

    质谱流式技术(Mass Cytometry)药物开发和生物制品表征中的潜力巨大。质谱流式细胞术将质谱技术与流式细胞仪相结合,能够实现对单个细胞的生化成分进行深入研究,帮助我们理解疾病机制,验证药物的效果,发现新的药物靶点以及增强生物制药质量控制。这在生物制品表征中非常有用,它可以帮助解决以下一些问题:

     

    单细胞层次的分子表征传统的质谱技术通常需要大量的样本以获取可靠的结果,而质谱流式技术则可以分析单个细胞的生化成分,这可以帮助我们更深入地理解细胞的生物学特性。

    生物分子的定量分析:质谱流式技术可以对细胞内的生物分子进行定量分析,包括蛋白质、代谢物和其他生物分子。

    细胞异质性的研究:细胞群体中的细胞并非完全相同,它们之间的差异可能影响疾病的发展和治疗的效果。质谱流式技术可以帮助我们研究这种细胞异质性。

     

    百泰派克生物科技BTP采用基于Fluidigm Helios流式细胞仪(Mass Cytometry System for Single Cell Analysis)用于单细胞质谱分析,该平台能够完成包括单细胞捕获、cDNA合成、实时定量PCR分析、目标区域扩增以及质谱流式细胞分析。

     

    对于一个质谱流式实验,明确了实验目的,确定实验指标,使用金属标签标记好的抗体之后,就可以进行样品染色。

     

    1. 单细胞悬液的制备

    质谱流式技术所需样本为单细胞悬液,如果使用血液样本,需要分离PBMC,如果使用组织样本,则需要对组织进行解离。

     

    1)外周血PBMC细胞的提取

    推荐使用肝素或者柠檬酸盐作为抗凝剂抽提全血,并在4小时内使用Ficoll或者Percol密度梯度离心法分离出PBMC和粒细胞等,注意尽量去除红细胞,检测细胞活率后及时冻存(图1)。

     

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    图1. 质谱流式细胞术密度梯度离心制备PBMC

     

    2)组织解离

    不同文章或不同组织的解离方法不同,可以使用各个公司的组织解离试剂盒来进行实验,或是参考文献方法来进行实验。组织解剖、酶消化和机械解离是导致细胞外基质降解和单细胞分离的三个重要步骤,评估固体组织酶促和机械解离后的三个关键参数是:1)细胞活力,2)没有细胞碎片,3)没有细胞聚集团块(图2)。

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    图2. 质谱流式细胞术组织解离实验过程

     

    对于不同组织,使用的酶组合也有差异(图3)。以胶原酶为例,胶原酶Ⅰ用于上皮、肺,脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞,用于哺乳动细胞的分离;胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分,分子量从68-130KD不等。它能消化多种组织;胶原酶Ⅴ包含至少7种蛋白酶成分,分子量从68-130KD不等。它可用于胰腺小岛组织的分离,将结缔组织分离成单个细胞;胶原酶Ⅱ适用于肝脏,骨,甲状腺,心脏和唾液腺组织。

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    图3. 质谱流式细胞术组织解离过程可用的酶及其功能

     

    2018年发表的一篇对于单细胞RNA测序研究实验设计的文章中,对于组织消化的处理进行了总结(图4),可供参考。

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    图4. 质谱流式细胞术制备单细胞悬浮液的组织特异性酶处理(来自人和小鼠样品)

     

    也可以参考已发表的质谱流式文章实验步骤来设计实验。

     

    文章1:High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity.

    手术切除后,在补充有20%胎牛血清(FCS)的IMDM + Glutamax培养基(Gibco)中收集肿瘤组织,肿瘤相关的淋巴结和结直肠健康黏膜。将样品在培养皿中切成小片,并在5 mL IMDM + Glutamax培养基中用1 mg/mL胶原酶D(Roche Diagnostics)和50ug/ mL DNase I(Roche Diagnostics)酶解30分钟。在温和的MACS C管中(Miltenyi Biotec)。孵育期间和之后,将细胞悬液在gentleMACS Dissociator(Miltenyi Biotec)上机械解离。通过70 um细胞过滤器(Corning)过滤细胞悬浮液,并在IMDM + Glutamax培养基中洗涤。用Muse细胞分析仪(Merck)上的Muse计数和活力试剂盒(Merck)测定细胞数目和活力。

     

    文章2:Systemic dysfunction and plasticity of the immune macroenvironment in cancer models.

    小鼠吸入CO2安乐死后,通过后腔静脉收集外周血,并转移到肝素钠包被的真空管中,然后在PBS中用5 mM乙二胺四乙酸(EDTA)和0.5%牛血清白蛋白(BSA)稀释)(PBS/EDTA /BSA)。将脾脏和淋巴结在4°C的PBS / EDTA中匀浆。从股骨冲洗骨髓,并在4℃下重悬于PBS/EDTA中。将肿瘤切碎并在RPMI-1640中用1 mg ml -1胶原酶IV和0.1 mg ml -1消化DNaseI。消化后,将重悬的细胞用PBS/EDTA在4°C淬灭。将所有组织用PBS / EDTA洗涤,并用PBS/EDT和100 mM顺铂(Enzo Life Sciences)1:1悬浮60s,然后用PBS/EDTA/BSA 1:1淬灭以确定活力,如先前所述24。将细胞在4°C下以500 g离心5分钟,然后以每毫升1×106至10×106个细胞的密度重悬于PBS/EDTA/BSA中。

     

    文章3:A Single-Cell Atlas of the Tumor and Immune Ecosystem of Human Breast Cancer .

    手术切除后,将新鲜组织样品立即转移至预冷的MACS组织存储溶液(Miltenyi Biotec)中,并在4°C下运输。收集后24小时内完成了组织处理。对于解离,使用手术刀将组织切碎,并根据制造商的说明,使用人的肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotech)和gentleMACS Dissociator(Miltenyi Biotech)进一步分解。将所得的单细胞悬液依次通过无菌的70-um和40-um细胞过滤器过滤。

     

    2. 细胞染色

    1)细胞计数,顺铂染色

    1、取不低于1×20230530-6023-00136.png个,用PBS重悬,将体积调至1 mL。

    2、加入终浓度0.5 uM的Cell-ID Cisplatin,混匀后室温放置2 min。

    3、加入 2 mL Cell Staining Buffer 终止反应,常温300xg 离心5 min。

     

    2)Fc blocking

    单个人 PBMC 样本:5 uL Fc Receptor Blocking Solution+50 uL CSB。

    单个小鼠样本:6.6 uL anti-CD16/32 抗体+48.4 uL Cell Staning Buffer)

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    3)表面抗体染色

    配制一抗cocktail,单个样品的抗体用量为 1.1uL,总体积 55 uL。

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    1、每管细胞加入 50 uL cocktail, 混匀,常温放置30分钟后。

    2、加入2 mL Cell Staining Buffer,常温 300xg 离心。重复一次。

     

    4)固定和透化

    1、在每个试管中加入1 mL Maxpar Fix I缓冲液,旋涡,室温孵育10-30 min。

    2、用2 mL Maxpar Perm-S缓冲液清洗细胞,

    3、800 x g离心5 min,弃上清,重复一次。

     

    5)胞内抗体染色

    1、在每管中加入50 uL的细胞质/分泌抗体Cocktail。

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    2、轻轻混匀样品,在室温下孵育30 min。

    3、孵育后每管加2 mL Maxpar Cell Staining Buffer洗涤,800xg离心5 min,弃上清。重复两次洗涤。

     

    6)DNA嵌入剂Ir染色

    1、离心完成吸上清后,加入100 uL PBS,使细胞沉淀充分悬起。

    2、加入1 mL cell intercalation溶液,立即吹匀,室温1小时或4℃过夜。

     

    7)细胞清洗,上机

    1、细胞洗涤后,用CASbuffer重悬样本,将细胞浓度调至1x20230530-3359-0017b.png个/mL。

    2、将样本置于冰上,每个样本上样前,过30 um滤筛,补充1/10体积 beads。

     

     

    关于我们

     

    百泰派克生物科技-生物药物表征,生物质谱多组学优质服务商

     

    北京百泰派克生物科技有限公司(Beijing Bio-Tech Pack Technology Company Ltd. 简称BTP)从事以生物质谱为依托的生物药物表征,大分子物质(包括蛋白质、多肽、代谢物)质谱分析以及小分子物质检测服务。

    1、公司采用ISO9001质量控制体系,专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务;

    2、获国家CNAS实验室认可,为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务;

    3、业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等;

    4、七大质量控制检测平台,满足您一站式服务需求;

    5、服务3000+企业,10000+客户的选择;

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    相关服务

    单细胞质谱流式技术分析

     

    参考文献:

    Reichard A, Asosingh K. Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry. Cytometry A. 2019 Feb;95(2):219-226. doi: 10.1002/cyto.a.23690. Epub 2018 Dec 6. PMID: 30523671; PMCID: PMC6375754.

    Lafzi A, Moutinho C, Picelli S, Heyn H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nat Protoc. 2018 Dec;13(12):2742-2757. doi: 10.1038/s41596-018-0073-y. PMID: 30446749.

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    Wu SZ, Al-Eryani G, Roden DL, Junankar S, Harvey K, Andersson A, Thennavan A, Wang C, Torpy JR, Bartonicek N, Wang T, Larsson L, Kaczorowski D, Weisenfeld NI, Uytingco CR, Chew JG, Bent ZW, Chan CL, Gnanasambandapillai V, Dutertre CA, Gluch L, Hui MN, Beith J, Parker A, Robbins E, Segara D, Cooper C, Mak C, Chan B, Warrier S, Ginhoux F, Millar E, Powell JE, Williams SR, Liu XS, O'Toole S, Lim E, Lundeberg J, Perou CM, Swarbrick A. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nat Genet. 2021 Sep;53(9):1334-1347. doi: 10.1038/s41588-021-00911-1. Epub 2021 Sep 6. PMID: 34493872; PMCID: PMC9044823.

     

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