药物开发和生物制品表征：质谱流式实验技术流程—抗体标记-百泰派克生物科技BTP

质谱流式技术（Mass Cytometry）在药物开发和生物制品表征中的潜力巨大。质谱流式细胞术将质谱技术与流式细胞仪相结合，能够实现对单个细胞的生化成分进行深入研究，帮助我们理解疾病机制，验证药物的效果，发现新的药物靶点以及增强生物制药质量控制。这在生物制品表征中非常有用，它可以帮助解决以下一些问题：

单细胞层次的分子表征：传统的质谱技术通常需要大量的样本以获取可靠的结果，而质谱流式技术则可以分析单个细胞的生化成分，这可以帮助我们更深入地理解细胞的生物学特性。

生物分子的定量分析：质谱流式技术可以对细胞内的生物分子进行定量分析，包括蛋白质、代谢物和其他生物分子。

细胞异质性的研究：细胞群体中的细胞并非完全相同，它们之间的差异可能影响疾病的发展和治疗的效果。质谱流式技术可以帮助我们研究这种细胞异质性。

百泰派克生物科技BTP采用基于Fluidigm Helios流式细胞仪（Mass Cytometry System for Single Cell Analysis）用于单细胞质谱分析，该平台能够完成包括单细胞捕获、cDNA合成、实时定量PCR分析、目标区域扩增以及质谱流式细胞分析。

与传统荧光流式相比，质谱流式的最大改变是检测指标从荧光标签到金属标签。传统流式细胞术用荧光基团作为报告分子，通过对发射光强度定量以确定目标分子的表达量。质谱流式细胞技术使用单一分子量的稳定镧系金属代替荧光基团作为报告分子，元素质谱分析仪能够通过分子量准确区分不同原子质量，并且不同镧系金属质量没有信号重叠，增加了定量的准确性。

一、抗体标记

在质谱流式实验中，设计好抗体panel后，可以直接购买金属标签标记好的抗体，也可以购买流式抗体自己标记金属标签。2008年，Angew Chem int ed Engl杂志上报道了多伦多大学一个研究团队开发的用于ICP-MS检测的一类新型元素标签。金属标签是一种含有多种金属螯合配体的水溶性聚合物，该聚合物含一个有马来酰亚胺基团的末端，用于与抗体Fc部分的半胱氨酸-SH基团偶联（图1）。通过-SH基团（由二硫键的选择性还原产生）将标签连接到抗体上，要比将标签随机共价连接到赖氨酸的氨基上更容易保持抗体的活性。

图1. 质谱流式细胞术金属螯合聚合物标记抗体的实验流程

Maxpar X8抗体标记试剂盒（Fluidigm）是当前市售的金属螯合聚合物（Metal conjugated polymer，MCP），使用硫醇-马来酰亚胺偶联方法将MCP与IgG抗体（Abs）共价偶联。聚合物上的马来酰亚胺端基允许在部分链间二硫键还原条件下选择性地偶联免疫球蛋白重链铰区的反应性硫醇基团（图2）。

图2. 质谱流式细胞术Maxpar X8抗体标记试剂盒抗体标记流程

但该方法依赖于半胱氨酸残基的存在和Abs还原步骤，因此某些类别的Abs（例如，IgMs和IgA）以及缺乏半胱氨酸残基的生物分子（例如，肽，凝集素和激素）无法使用此方法有效标记。近年来，也有许多研究开发新的偶联策略，用于标记各种生物分子和亲和试剂。例如，有研究人员使用一类新的叠氮或反环辛烯末端的MCPs与无铜（I）应变促进的烷基-叠氮环化反应或四嗪-烯点击化学反应，其中具有-NH2功能团的生物分子分别被二苯环辛烯或四嗪分子选择性地激活。这种方法能够产生高度敏感和特异的金属标记的IgG、IgMs、小肽和凝集素，应用于免疫分型和糖生物学（图3）。

图3. 质谱流式细胞术基于点击化学偶联方法用于各种蛋白质、肽和荧光标记

目前常见的质谱流式金属标签是基于1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸等配位基团的聚合物金属标签，每条聚合物链上仅连有20-50个金属原子，相当于每个抗体上连有150-200个金属原子，无法实现低丰度标志物的检测。近年来也有新的研究结果报道新金属同位素载体的开发。例如，有研究团队将稀土、锆和铪等金属元素通过溶胀的方法掺杂到聚苯乙烯纳米颗粒中，并进行抗体偶联，制备了一系列质谱流式金属标签，实现了对单核细胞（MNCs）的单细胞高灵敏多指标检测。有研究团队构建了一类基于介孔卟啉框架（MPF）纳米颗粒的新型金属标记体系，将非镧系金属如Pd、Sn、W和Pt成功应用到CyTOF检测中，有望成为显著扩大CyTOF检测通道的有力工具[4]。

总的来说，用于质谱流式金属标记的聚合物必须满足几个重要标准。首先，聚合物应该有一个相对较窄的链长分布，这样每个标记的抗体都携带类似数量的金属离子。第二，金属的结合方式必须使它们在储存或应用过程中不发生交换。第三，该聚合物必须包含用于抗体连接的官能团。最后，该聚合物必须是水溶性的，因为生物测定是在水介质中进行的。虽然含有聚氨基甲酸酯螯合剂的金属螯合聚合物是为结合镧系元素而设计的，具有很高的水溶性，但镧系元素以外的一些金属离子的螯合剂是相当疏水的。带有疏水螯合剂的金属螯合聚合物需要额外的增溶分子来使其具有水溶性。

金属标签标记抗体后，需要通过测量280 nm处的吸光度来量化共轭抗体的回收率以及对偶联抗体滴定确定最佳的染色浓度。抗体滴定的本质是在抗体的特异性与非特异性结合中寻找最佳的平衡。过低浓度的抗体无法饱和或有效结合抗原位点，导致染色不均或信号较弱；而过高浓度的抗体引起低亲和非特异性结合效率的提升，此时阴性、阳性群体信号均增加，但分群效果下降。通过抗体滴定工作曲线，选用不引起背景明显提升且信噪比最佳的染色条件，可在节约抗体用量的同时降低背景干扰，提升数据质量。

二、样品barcoding

质谱流式实验中，为了在关键样品之间进行最精确的比较，可以对单个样本进行条形码编码（barcoding），使多个样品能够合并以进行下游染色和采集。这些策略使用一组金属的不同组合，并且这些组合中的每一个都用作单个样品的唯一条形码。用这些条形码金属对样品进行染色后，可以将多个样品汇集到同一管中，然后用抗体混合物进行染色。数据收集后，通过识别具有特定条形码的每个细胞，在分析之前对每个相应的样品进行去卷积。质谱流式的barcode试剂是基于mDOTA（maleimido-mono-amide- DOTA）分子改造的，mDOTA是一个双功能化合物，一端可以螯合金属离子，一端则可以和细胞中蛋白上的自由巯基以共价键形式结合（图4）。

图4. 质谱流式细胞术mDOTA标记原理

在质谱流式仪器中共价键被打碎后，每种镧系金属元素的峰即可形成有和无两种情况，使用的镧系金属元素螯合的mDOTA试剂的种类越多，最终可组成的条形码种类越多，使用7种镧系金属元素螯合mDOTA试剂，可以组成2的7次方种条形码，即可以同时标记128个样品（图5）。

图5. 质谱流式细胞术7种金属标签barcode原理

Cell-ID™ 20-Plex Pd Barcoding Kit是Fluidigm公司开发的样品标记试剂盒，可以通过6个金属标签的组合（102, 104, 105, 106, 108, 110）对20个样品进行标记（图6）。

图6. 质谱流式细胞术Cell-ID™ 20-Plex Pd Barcoding Kit样品标记原理

经过barcode试剂标记的样品经过质谱流式分析后，收集的数据是包含了所有复用样品的综合数据，因此必须进行解码，以便进行下游分析。解码器软件（Debarcoder）可以对样品进行解码，并为每个条形码样品创建单独的FCS文件，用于下游分析。复合的文件包含了理想的单细胞事件和不理想的事件，如碎片、跨样本聚集和跨样本离子融合。最佳的解码结果是准确地分配最大数量的理想事件，并在解码后的输出文件中尽量不包含不希望或不确定的事件（图7）。

当一个文件被加载到Debarcoder时，通过将其三个最亮的Pd同位素的身份与相应的条形码键相匹配。任何少于3个Pd染色的事件或与任何其他事件关联性差的事件都会从数据中删除。解码器提供了两个计算参数用于从解码后的数据中消除不需要的事件，Barcode Separation（BcS）和Mahalanobis Distance（MD）。BcS是对具有第三和第四高强度的同位素之间rescaled强度差异的测量。rescaled是通过将每个Pd强度除以条形码中最亮的Pd的平均值+2SD值来计算的。使用rescaled强度可以纠正整体染色强度的差异，这可能是由于细胞对Pd吸收的特异性变化或条形码样品中细胞数量的变化造成的。MD量化了六维Pd强度空间中一个事件和其分配的条形码群体分布之间的距离。细胞碎片聚集等事件在Pd强度空间中偏离单细胞群的中心，导致MD值升高。然而，条形码样品包含一些有效的细胞，它们可能在Pd吸收方面与样品中的大多数事件不同，这样的事件也会被严格的MD所过滤。因此，在实验中应谨慎使用MD作为辅助过滤器。最好是使用BcS进行初级过滤，只在特殊情况下使用MD作为二级过滤。

图7. 质谱流式细胞术Debarcoder软件中的样品事件图举例。

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