药物开发和生物制品表征：质谱流式实验技术流程——panel设计-百泰派克生物科技BTP

质谱流式技术（Mass Cytometry）在药物开发和生物制品表征中的潜力巨大。质谱流式细胞术将质谱技术与流式细胞仪相结合，能够实现对单个细胞的生化成分进行深入研究，帮助我们理解疾病机制，验证药物的效果，发现新的药物靶点以及增强生物制品质量控制。

质谱流式实验整个流程可以分为四大部分：panel设计、样品制备、上机获取数据和数据分析（图1）。其中panel设计是最初也是最重要的步骤，它决定了整个实验分析的指标和后续分析的侧重点。

图1. 质谱流式细胞术工作流程（图片来源：https://www.standardbio.com）

1、确定检测指标

确定检测指标之前，首先需要对于整个实验的目的有清楚的认识，最好首先回答以下问题：

（1）关注什么问题？疾病相关、细胞谱系发育还是其他。

（2）实验样本来源？人、小鼠还是其他。

（3）实验样本是什么？血液、组织还是其他。

（4）关注什么细胞类型？多种免疫细胞、肿瘤细胞、某种特定的细胞类型等。

（5）希望检测什么指标？免疫细胞分型marker、胞内信号通路及磷酸化水平、

细胞因子分泌变化还是其他。

（6）指标类型？经典的标志物、非通用的潜在标志物还是其他。

（7）检测指标的细胞定位？细胞膜还是细胞质。

明确了研究目的后，就可以开始确定检测指标。最常见的使用质谱流式研究的思路是比较不同情况下，机体免疫系统的变化，也就是免疫细胞丰度和亚群的差异。一般了解免疫细胞常见的细胞表面标志物有三种方法，分别是抗体公司网站、标志物数据库和文献调研（图2）。细胞分型是流式检测的重要应用方向，因此各个抗体公司均有对现各细胞标志物的总结。一些标志物数据库也会对各细胞或组织进行总结。通过文献调研也可以知道细胞标志物如何选取，一般在文章的方法部分或补充治疗中都会对指标的选择进行描述。除了细胞表面的标志物以外，质谱流式还能检测胞内细胞因子以及信号通路等一系列指标，可以根据实验需要合理搭配检测指标。

图2. 质谱流式细胞术了解细胞表面经典marker的方法

2、质谱流式可用的抗体要求

确定的检测指标之后，还需要确定检测的指标是否有适配质谱流式实验的抗体。目前，用于质谱流式实验的抗体可以分为两大类：已有金属标签标记的抗体和需要自行标记金属标签的流式裸抗。已有金属标签标记的抗体可以从质谱流式仪器的厂家购买。如果现有的金属标记抗体不能满足实验需求，可以购买流式裸抗自行标记金属标签，而购买的流式抗体可以通过多个厂家购买，需注意的是抗体应是Purified以及标注了适用FC，ICFC，CyTOF-ready（图3）。

图3. 可用于质谱流式细胞术的流式裸抗示例（红色标注为重要的筛选指标）

3、质谱流式的金属通道特点

质谱流式相对于传统流式技术的主要差异在于使用金属元素及其同位素作为抗体标签，目前用作标签的主要有稀土元素、惰性元素、后过渡金属和卤素，这些元素在细胞内含量少，不会引起高背景（图4）。

图4. 质谱流式细胞术使用的金属元素分布

质谱流式对于各个金属通道检测的灵敏度不同。以Helios为例，理论上它能够检测多达135个金属通道，范围为75-209 amu。然而，Helios仪器内的离子光学器件被调整为对159-169Da范围内的金属检测最为灵敏，特定质量通道的相对灵敏度与相应同位素通过Helios质谱仪的离子光学系统的传输效率成正比（图5）。

图5. 质谱流式细胞术Helios对不同质量金属的灵敏度响应曲线

传统流式的荧光信号溢出会影响到临近的通道，而对于质谱流式而言，这个问题没有那么严重，但是也存在着少量的干扰（图6）。

图6. 质谱流式细胞术金属通道之间的干扰

主要由以下几个原因导致：

（1）同位素纯度不够（Impurities）。

自然存在的元素是同位素的混合物，质量标签的富集度与该同位素的自然丰度有关。当同位素的自然丰度超过20%时，通常可以达到98%以上的富集度，每种同位素的纯度是在生产时确定的。当同位素自然丰度不够时，可能导致其纯度的降低（图7）。

图7. 质谱流式细胞术金属纯度的差异（以镉同位素为例，106Cd-116Cd）

（2）丰度灵敏度（Abundance Sensitivity）

M±1，是指相邻通道的溢漏，被称为丰度灵敏度，简单说就是质量为M的峰的拖尾，在 M+1和M-1质量上的信号干扰。在质谱流式仪器中的飞行时间质谱，离子是根据它们的相对速度来分辨的，这些速度由它们的质量和动能决定。质量差异极小的离子在初始位置和速度上相互之间有很小的差异，这些位置和速度的差异导致了质量峰的扩大，导致一些信号可以在相邻的质量通道中测量。丰度灵敏度在不同仪器的特定操作条件下是一个固定值，通常CyTOF小于1%，CyTOF 2和Helios小于0.3%。

（3）氧化物干扰（Oxides）

M+16，是指同位素氧化导致的干扰，如轻镧系元素（139～160 amu）因为氧化物的形成，导致了对重镧系元素（155~176 amu）通道产生干扰。在等离子体电离源的高温下，氧化物的丰度由原子离子-氧键强度决定。La、Ce、Pr和Nd同位素产生最大的M+16信号（通常为2-3%），而Eu同位素形成最弱的M+16信号（通常<0.1%）。89Y, 102Pd, 104Pd, 105Pd, 106Pd, 108Pd, 110Pd, 113In, 115In, 和 209Bi 同位素不会产生氧化干扰，也不会对轻、重镧系元素产生氧化干扰。

4、将检测指标与金属通道匹配

通过合理的将检测指标和金属通道匹配，可以最大程度的减弱各通道之间的干扰进而达到最佳的检测效果。

首先，了解各个金属通道特点。根据金属通道的特点，可将金属通道分为四种类型（图8）：（1）基本不受影响，也不影响其他通道的金属；（2）基本不受影响，但会影响其他通道的金属；（3）基本不影响其他通道，但会受其他通道影响的金属；（4）其他。

图8. 质谱流式细胞术金属通道特点

（绿色，表示基本不受影响，也不影响其他通道；蓝色，基本不受影响，但会影响其他通道；红色，基本不影响其他通道，但会受其他通道的影响。其他的通道背表示为黄色）

其次，了解各个指标流式抗体的特点。不同的蛋白在细胞中的表达强度不同，因此需要计算各个指标流式抗体的Signal和Tolerance这两个指标。Signal被定义为流式分布中最强阳性群的75分位数，是反映一个抗体的信号强度的数值。Tolerance一般是流式图分布的75分位数的20%，反应了一个抗体信号的抗干扰能力，但在不同的流式分布中有不同的计算方法（图9）。Signal和Tolerance不需要计算的非常精确，估计出来的数据基本可以反映一个抗体大概的强弱情况，即可满足要求。

图9. 质谱流式细胞术抗体Signal和Tolerance计算

最后，就是将抗体和金属通道相匹配。同传统流式一样，针对不同表达丰度的标志物，也遵循「强弱搭配」原则，即表达丰度高的标志物选择较低或中等灵敏度的同位素标签；表达丰度低的标志物选择高灵敏度的同位素标签。对于表达丰度低或未知的抗原：选择高灵敏度通道，如 153–176Ln、209Bi；选择不会或很少受到其他通道干扰的通道。对于表达丰度高的抗原：选择较低灵敏度的标签（89Y, 102–110Pd, 113In, 115In）或中等灵敏度的标签（139–152Ln）；选择不会或很少干扰其他通道的通道；优化抗体浓度，使用满足需求的最低抗体浓度，从而降低对其他通道的干扰。此外，还可以遵循以下规则：互斥抗原（如 CD4 和 CD8）可以安排在有干扰的通道。共表达抗原（如 CD3 和 CD4）安排在互不干扰的通道。

质谱流式仪器的公司也提供了panel设计的软件（Maxpar Panel Designer v2.0 Software），可以申请账号来在线使用该软件。

参考文献：

[1] Zhang X, Lan Y, Xu J, Quan F, Zhao E, Deng C, Luo T, Xu L, Liao G, Yan M, Ping Y, Li F, Shi A, Bai J, Zhao T, Li X, Xiao Y. CellMarker: a manually curated resource of cell markers in human and mouse. Nucleic Acids Res. 2019 Jan 8;47(D1):D721-D728. doi: 10.1093/nar/gky900. PMID: 30289549; PMCID: PMC6323899.

[2] Chevrier S, Crowell HL, Zanotelli VRT, Engler S, Robinson MD, Bodenmiller B. Compensation of Signal Spillover in Suspension and Imaging Mass Cytometry. Cell Syst. 2018 May 23;6(5):612-620.e5. doi: 10.1016/j.cels.2018.02.010. Epub 2018 Mar 28. PMID: 29605184; PMCID: PMC5981006.

[3] Maxpar Panel Designer User Guide

（https://www.standardbio.com/area-of-interest/panel-design#highlights-anchor）.

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