药物开发和生物制品表征:质谱流式仪器构成及各部分原理介绍-百泰派克生物科技BTP

    质谱流式技术(Mass Cytometry)在药物开发和生物制品表征中的潜力巨大。质谱流式细胞术将质谱技术与流式细胞仪相结合,能够实现对单个细胞的生化成分进行深入研究,帮助我们理解疾病机制,验证药物的效果,发现新的药物靶点以及增强生物制药质量控制。这在生物制品表征中非常有用,它可以帮助解决以下一些问题:

    单细胞层次的分子表征:传统的质谱技术通常需要大量的样本以获取可靠的结果,而质谱流式技术则可以分析单个细胞的生化成分,这可以帮助我们更深入地理解细胞的生物学特性。

    生物分子的定量分析:质谱流式技术可以对细胞内的生物分子进行定量分析,包括蛋白质、代谢物和其他生物分子。

    细胞异质性的研究:细胞群体中的细胞并非完全相同,它们之间的差异可能影响疾病的发展和治疗的效果。质谱流式技术可以帮助我们研究这种细胞异质性。

    百泰派克生物科技BTP采用基于Fluidigm Helios流式细胞仪(Mass Cytometry System for Single Cell Analysis)用于单细胞质谱分析,该平台能够完成包括单细胞捕获、cDNA合成、实时定量PCR分析、目标区域扩增以及质谱流式细胞分析。

     

    质谱流式分析可分为五个主要过程:样品引入和电离、离子通过真空锥体接口、离子筛选、飞行时间(TOF)质量分析、数据的采集和处理。

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    图1. 质谱流式细胞术Helios系统示意图,颜色表示主要过程。

     

    1、样品引入和电离

    质谱流式样本制备完毕后以细胞悬液的状态进入仪器,通过雾化器(Nebulizer)被分成小液滴,每个液滴包含一个细胞。包含细胞的液滴随后进入雾化室(Spray chamber),高温使气溶胶部分气化并引向ICP源。整套过程使用氩气来进行提供气体环境与压力(图2)。

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    图2. 质谱流式细胞术样品导入系统将液体样品制成包含单个细胞的液滴并气溶胶化,进而导入ICP源进行电离。

     

    在细胞悬液雾化阶段,需要使用被称为雾化器(Nebulizer)的装置。雾化器包括一个携带液体样品的内部毛细管和一个携带氩气的外室。氩气以大约0.15-0.25 L/min的速度在外室流动,毛细管内的样品在大气压力下移动,当样品从尖端流出时,雾化器气体对液体施加的剪切力将其分解成细小的气溶胶液滴进入雾化室(图3)。

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    图3. 质谱流式细胞术雾化器结构图。

     

    雾化室(Spray chamber)外部设有加入装置,其温度可达到200 ˚C,在雾化室中高流量的加热氩气将气溶胶液滴部分蒸发,缩小其尺寸,以便进入等离子体炬被离子化(图4)。

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    图4. 质谱流式细胞术雾化室结构图。

     

    等离子体炬(Torch)由三个同心室组成:矩管,两个同心石英管融合组件以及一个石英样品注入管。最外侧的腔室中的氩气流量为18 L/min,被点燃后形成等离子体。中央室的氩气流量约为1 L/min,用于改变等离子体底部相对于样品注入管的位置。最内侧的腔室将氩气流和样品气溶胶传送到等离子体的中心。全部组件安装在一个电感线圈内,该线圈的电流是由射频(Radio frequency,RF)产生的,这种电流产生了维持等离子体的电磁场。

    在负载线圈产生的电磁场内的等离子体是通过氩气的电离而形成。首先,氩气从炬管的外腔切向流动,提供给负载线圈的射频电流在氩气离开外腔时产生了一个强大的电磁场,高压电火花将电子从氩原子中剥离出来。这些自由电子在电磁场中加速,并以足够的能量碰撞,使氩气发生电离。当气溶胶样品通过样品注入管被引入等离子体时,水滴被迅速汽化,单个细胞随后被汽化,形成原子云,然后被电离(图5)。

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    图5. 质谱流式细胞术等离子体炬结构图。

     

    质谱流式样品的引入和电离体系均使用氩气。为什么要用氩气(Ar)?首先氩气是惰性气体,并且具有相对便宜,易获得高纯度气体的优点。更重要的是Ar 的第一电离能是15.75电子伏特 (eV),高于大多数元素的第一电离能 (除了He, F, Ne),低于大多数元素的第二电离能 (除了Ca, Sr, Ba,etc),等离子体的电离环境由氩气组成, 大多数元素可以被有效地电离为单电荷离子。

     

    2、离子通过真空锥体接口

    在大气压力(760 Torr)下产生的等离子体通过真空锥体接口(图6)。真空锥体接口的目的是将离子从大气压力下的等离子体有效地输送到容纳离子光学器件的腔室中,其压力小于10-3 Torr。Helios使用3个锥体接口将等离子体输送到低压真空中:取样器(直径1.1 mm的孔口)、撇渣器(直径1 mm的孔口)和减压器(直径1.2 mm的孔口)。所有3个锥体都是由镍制成的,接口外壳是水冷的,以减弱等离子体产生的热量。3个锥体可以减少等离子体的压力并将离子聚拢到下游的离子光学器件。

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    图6. 质谱流式细胞术等离子体通过真空锥体接口示意图。

     

    3、离子筛选

    离开真空接口的离子云含有低质量的离子,它们不具有分析意义,而且丰度很高,易会损坏检测器。四级杆由四根带有直流电压(Direct current,DC)和射频电压(RF)的平行杆构成,相对的一对电极是等电位的,两对电极之间电位相反。当一组质荷比不同的离子进入由直流电压和射频电压组成的电场时,只有满足特定条件的离子作稳定振荡通过四极杆。质谱流式的离子筛选系统从离子束中去除不需要的低质量的氩和其他离子,一个只包含高质量同位素的离子流(>75 amu)被引导通过这个通道,进入飞行时间质谱(图7)。

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    图7. 质谱流式细胞术离子筛选示意图。

     

    4、飞行时间(TOF)质量分析

    从离子光学系统出来的离子云被送到飞行时间(TOF)质量分析仪中,它根据质量电荷比(m/z)分离离子。离子进入TOF分析器的加速器后,以13 μs的间隔(频率为76.8 kHz),数百伏的脉冲将累积的离子正交加速到反射器上,反射器将离子重新定向到检测器上。无论离子初始位置或能量如何,通过加速器和反射器中的电场配置,都能将离子聚焦到紧密的时间分辨带(图8)。

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    图8. 质谱流式细胞术飞行时间(TOF)质量分析示意图。

     

    离子飞向检测器的时间与它们的质荷比(m/z)之间的关系是:

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    其中t0和A是从质量校准程序中得出的。ICP使金属原子电离主要变成单一的正电荷状态。每一团离子云都被分解成一系列的带,最轻的同位素探针首先到达检测器,而每个连续的较重质量的同位素在稍后的时间到达检测器。每个质量为M的离子的飞行时间分辨带与其质量为M±1的离子相隔20-25 ns。在第一组离子被推出并被检测到后,第二个脉冲将下一组离子推出来进行检测,循环往复直到数据采集完成。

    在TOF中分离的离子用一个动态电子倍增器来检测。当一个离子撞击检测器的第一个动态节点时,几个二次电子被释放出来。这些电子撞击下一个动态节点,在那里产生更多的电子。这个过程在每个动态节点上重复,形成一个电子脉冲,被探测器的阳极捕获。输出的模拟信号被放大并由一个双8位数字转换器转换为数字值。8位数字转换器以1 ns的采样间隔进行数据转换。

     

    5、数据的采集和处理

    质谱流式系统使用TOF解析多元素样品,每个同位素的离子在离散的20-25 ns的时间窗口到达检测器,这取决于它们的质荷比。在非常低的离子浓度下,脉冲信号重叠的概率可以忽略不计,通过简单地计算脉冲的数量(Counts)可以最精确地确定离子计数(图9左)。随着离子浓度的增加,离子脉冲开始在同一时间到达检测器。在这种情况下,脉冲数低估了真正的离子数,而强度(Intensity)成为更准确的测量(图9右)。

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    图9. 质谱流式细胞术分析物浓度对信号测量的影响。

     

    质谱流式收集的数据范围要求收集双重数据,这意味着每个通道都要收集脉冲计数(Pulse count)和强度值(Intensity)。CyTOF软件将整个数据范围绘制在一个单一的双信号刻度上,其单位是击中检测器的粒子的实际计数。为了实现这一点,需要做两件事。首先,应用一个双计数系数,根据以下公式将模拟强度转换为实际计数。

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    第二,应用一个双转换阈值,低于这个阈值时使用脉冲计数,高于这个阈值时使用系数转换的模拟强度的计数。使用双计数系统,质谱流式可以在广泛的信号输入范围内对每个细胞的结合抗体标签进行量化。数据被保存为文本(.txt)和流式细胞仪标准(.fcs)3.0格式,以便在兼容的软件中进行数据分析。

     

    关于我们

    百泰派克生物科技-生物药物表征,生物质谱多组学优质服务商

     

    北京百泰派克生物科技有限公司(Beijing Bio-Tech Pack Technology Company Ltd. 简称BTP)从事以生物质谱为依托的生物药物表征,大分子物质(包括蛋白质、多肽、代谢物)质谱分析以及小分子物质检测服务。

    • 公司采用ISO9001质量控制体系,专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务;
    • 获国家CNAS实验室认可,为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务;
    • 业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等;
    • 7大质量控制检测平台,满足您一站式服务需求;
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    • 致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

     

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    相关服务

    单细胞质谱流式技术分析

     

    参考文献:

    Helios User Guide Chapter2 (https://www.standardbio.com/support/instrument-support/cytof-helios-support)

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