TMT标记定量质谱工作流程详解
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Reporter group：用于MS2或MS3定量（m/z 126–131, 可扩展至TMTpro 16-plex或18-plex）
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Balancer group：调节整体标签的分子质量，使标记前各试剂等质量
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Reactive group：与肽段N端或赖氨酸侧链的氨基反应，实现共价标记
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蛋白还原（DTT）
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烷基化（IAA）
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酶解过夜（37°C, 酶：底物=1:50）
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溶液缓冲环境：通常使用无氨基缓冲液（如TEAB）
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反应时间：60分钟室温
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停止反应：添加氢氧化氨水或氨基酸中和多余试剂
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高pH反相色谱
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离子交换（SCX）
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电泳法（SDS-PAGE、OFFGEL）
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电喷雾电离（ESI）
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正离子模式
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DDA模式或DIA+DDA混合策略
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TMT定量模式（MS2 or SPS-MS3）
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Proteome Discoverer（Thermo平台）
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MaxQuant（兼容多平台）
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Spectronaut（DIA兼容）
随着生命科学研究向更精细化和大规模系统层面推进，定量蛋白质组学成为解析生物系统动态变化的关键工具。尤其是在肿瘤异质性研究、药物作用机制探索、疾病标志物筛选等方向，基于质谱的定量方法展现出极大的应用潜力。其中，TMT（Tandem Mass Tag）标记技术因其高通量、低批间差、定量准确性高等优势，已成为多条件比较实验中的首选方法。
一、什么是TMT标记？原理简述
TMT是一种基于同位素编码的化学标签技术，通过将不同样本的肽段标记上质量相等、结构相同但碎裂后释放出不同Reporter离子（报告离子）的试剂，实现多样本的相对定量分析。
每个TMT试剂包含三个关键结构单元：
由于所有样本在标记后被混合并共同进入LC-MS/MS流程，因此批间差显著降低，实验重复性和定量一致性显著提升。
二、TMT标记定量质谱的标准工作流程
1、蛋白提取与定量
实验流程从样本的蛋白提取开始，根据样本类型（细胞、组织、血清/血浆等）选择合适的裂解方式（如RIPA、SDS、尿素等）。关键要求是保证蛋白充分溶解、完整性良好。
之后，使用BCA或Bradford方法进行蛋白定量，确保每个样本输入量一致（通常推荐≥100 μg）。
2、蛋白酶解（酶解效率直接影响定量质量）
采用Trypsin酶解为主流方案，常搭配Lys-C双酶体系增强切割效率，尤其适用于高盐或高变性样本。酶解步骤通常包括以下流程：
此步骤得到肽段混合物，后续用于TMT标记。
3、TMT标记反应
每组样本分别用不同的TMT试剂进行标记，反应条件包括：
标记效率需＞95%，百泰派克生物科技会在流程中设置质控点，使用小规模样本先行验证标记是否完全。
4、样本混合与分级（Fractionation）
标记完成后将不同样本等量混合，得到统一的复合样本混合物。此时样本复杂度较高，需进一步通过高pH反相色谱进行分级（fractionation），提升质谱覆盖度。
常用方法包括：
分级数一般为8–20个fraction不等，取决于样本复杂度与研究深度要求。
5、LC-MS/MS分析（高分辨率质谱平台）
进入质谱分析阶段，百泰派克采用Orbitrap Exploris 480 / Fusion Lumos / timsTOF等高端平台，结合纳升液相（nanoLC），在MS2或MS3水平实现定量。
参数设置要点包括：
其中，SPS-MS3模式可有效减少共碎裂引起的比率压缩（Ratio Compression）问题，提升定量准确性。
6、数据分析与生物信息学解读
质谱原始数据经软件解析，如：
匹配数据库（Uniprot/RefSeq），筛选可信肽段（FDR＜1%），输出蛋白表达量数据矩阵。
随后进入差异蛋白筛选、GO/KEGG富集分析、聚类分析、网络分析（PPI）、可视化建图等阶段。
三、百泰派克生物科技的优势TMT服务体系
在TMT定量蛋白组学方向，百泰派克生物科技依托自建的高通量质谱平台与成熟的样本处理体系，为客户提供端到端的一站式解决方案：
1、样本前处理经验丰富，适配多种复杂类型（FFPE、血浆、微量组织）；
2、灵活支持TMT 6/10/11/16/18 plex标记；
3、数据分析深入，包括生物通路、疾病富集、靶点预测；
4、严格质控：标记效率、蛋白覆盖率、技术重复性等全程监控；
5、可结合代谢组、转录组等进行多组学联分析。
TMT标记质谱已成为探索蛋白表达变化的核心技术，尤其适合多组别、多重复、对比研究明确的课题设计。无论是基础研究还是临床转化，准确、可重复的定量结果都是数据可信度的根基。百泰派克生物科技将持续优化TMT定量质谱平台，以高标准交付数据、高质量支持科研，为生命科学研究提供坚实支撑。
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