基于TMT的单细胞蛋白质组学
随着单细胞转录组和空间组学的快速发展，研究者对单细胞水平的蛋白质动态变化也提出了更高需求。质谱蛋白质组学通常需要数千到数万细胞作为起始量，这限制了在稀有细胞类型（如免疫亚群、干细胞、肿瘤循环细胞）上的应用。近年来，结合Tandem Mass Tag（TMT）多重标记的单细胞蛋白质组学技术逐渐成熟，使得单细胞乃至十几个细胞的蛋白表达谱成为可能，推动精准医学和基础生物学研究。
一、单细胞蛋白质组学的挑战
1、超低起始量
单细胞蛋白质含量通常仅为 0.2–1 ng，远低于质谱检测需求（常规需 ≥1 µg），易导致检测灵敏度不足和覆盖度偏低。
2、样品损失严重
（1）样品在提取、酶解、清洗过程中易损失；
（2）痕量样品的表面吸附效应显著，需要优化反应体系。
3、定量精度受限
（1）低信号强度使得随机噪声放大；
（2）Label-free 定量无法有效对抗技术波动。
二、TMT 技术为何适合单细胞研究？
1、TMT 多重标记的优势
（1）可将单细胞样本与“载体通道（Carrier Channel）” 混合分析，显著提高质谱检测灵敏度；
（2）多个单细胞样本在一次 LC-MS/MS 运行中并行检测，降低批次效应；
（3）Reporter 离子强度用于定量，可精确区分单细胞之间的蛋白表达差异。
2、“载体通道”策略
（1）载体通道通常含有 50–200 个细胞的蛋白质，提供足够的信号以辅助鉴定；
（2）单细胞信号通过 TMT 其他通道进行独立定量，避免信号丢失；
（3）配合 MS3 或 SPS-MS3，可进一步缓解比值压缩问题，提升定量精度。
三、基于 TMT 的单细胞蛋白质组学流程
1、样本制备
（1）采用微量裂解体系（如 SDC、SDS 低体积体系）降低损失；
（2）利用自动化液体处理系统（如 CellenONE）实现单细胞分选与转移。
2、酶解与 TMT 标记
（1）在低体积（<1 µL）条件下完成酶解，减少吸附损耗；
（2）各单细胞及载体通道分别用不同的 TMT 标签标记。
3、混合与分离
（1）将标记样本等量混合后进行 LC-MS/MS；
（2）使用高分辨率 Orbitrap 或 timsTOF 平台检测。
4、数据处理
（1）利用 Proteome Discoverer 或 MaxQuant 提取 Reporter 离子信号；
（2）通过归一化和 FDR 控制，筛选差异蛋白并分析单细胞异质性。
四、典型应用场景
1、肿瘤异质性研究
解析肿瘤组织中不同细胞亚群的蛋白表达谱，发现耐药相关通路和标志物。
2、免疫细胞动态监测
追踪免疫细胞（T、B、NK 等）在疾病进程或药物作用下的功能状态。
3、干细胞与发育研究
探索单个干细胞的分化潜能和信号调控网络。
4、药物筛选与精准医学
在单细胞水平评估药物作用机制，指导个体化治疗策略。
五、方法优化与注意事项
1、降低背景干扰
（1）使用低吸附管材，减少痕量样品损失；
（2）载体通道设置合理比例，避免 Reporter 离子溢出。
2、减少比值压缩
（1）采用 SPS-MS3 工作流，显著提升定量精度；
（2）对高复杂度样本可结合离线分级（High-pH Fractionation）。
3、提高数据可信度
（1）设置生物学重复，避免统计假阳性；
（2）利用 QC 样本监控质谱性能和批次效应。
基于 TMT 的单细胞蛋白质组学打破了质谱的起始量限制，让科研人员能够解析单细胞层面的生物学动态。通过合理设计实验、优化载体通道比例及采用 SPS-MS3 技术，可以获得高覆盖度与高精度的定量结果。如需开展单细胞 TMT 蛋白质组学研究，或探索肿瘤异质性、免疫动态等前沿课题，欢迎联系百泰派克生物科技，获取专业的实验方案与合作支持。
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