如何利用SPS-MS3优化TMT工作流程并减少比值压缩？

TMT（Tandem Mass Tags）是一种广泛应用于高通量蛋白质定量分析的同位素标签技术，可实现多样本并行检测（目前最多可支持18-plex），在疾病机制研究、药物作用机制解析和临床生物标志物筛选中显示出强大优势。然而，比值压缩（Ratio Compression）是TMT定量中最主要的技术瓶颈之一。由于共洗脱肽段在MS2级别的干扰，导致目标肽段的报告离子强度不准确，从而引发定量结果低估，尤其在低丰度蛋白质中更为明显。为了克服这一难题，同步前体选择MS3（Synchronous Precursor Selection-MS3, 简称SPS-MS3）技术被提出并逐渐成为TMT高精度定量中的核心策略之一。

 

一、比值压缩的成因：从MS2层面解析

在TMT-MS2工作流程中，肽段在一级质谱（MS1）被筛选后进入碰撞诱导解离（CID）或高能碰撞解离（HCD）阶段。此时，除了目标肽段，还常常伴随着共洗脱干扰离子（co-isolated precursors），这些干扰离子在MS2中也被碎裂，进而释放出非目标肽段的TMT reporter离子，导致定量信号混淆，从而压缩真实的表达比值。

 

二、SPS-MS3的原理与优势

1、什么是SPS-MS3？

SPS-MS3 是一种基于Orbitrap Tribrid平台（如Fusion Lumos、Eclipse等）开发的高级定量模式，核心思路是在第二次碎裂（MS3）中选取多个目标离子进行同步分析，从而显著降低共洗脱干扰。

工作机制：

• MS1：筛选目标肽段前体离子
• MS2：初步碎裂，产生b/y离子群
• SPS选择：从MS2碎片中选取多个高强度b/y离子（通常为10个）
• MS3：将这批SPS选择的离子再进行一次高能碎裂，生成TMT reporter离子进行定量

 

2、SPS-MS3的关键优势

• 显著降低比值压缩：通过从多个MS2碎片离子而非原始前体进行定量，有效排除共洗脱干扰离子
• 提高定量精度与可信度：尤其对低丰度蛋白的差异表达识别更敏感
• 提升重复性：在多次重复实验中表现出更稳定的定量性能

 

三、如何优化TMT工作流程以最大化SPS-MS3效能？

1、仪器设置优化

（1）SPS离子数量：建议选择8~10个高强度MS2碎片作为SPS离子，避免选取干扰或背景离子；

（2）MS3分辨率：建议设定为60,000（Orbitrap）以上，确保TMT报告离子高分辨分离；

（3）激发能量（NCE）：MS3阶段推荐使用较高的NCE（如65~70%）以确保reporter离子释放充分。

 

2、样品前处理优化

（1）高pH反相分级（HpH fractionation）：提升肽段复杂度控制能力，降低共洗脱概率；

（2）蛋白酶切效率：确保肽段完整性和定点切割，减少非特异性背景离子；

（3）去除高丰度蛋白：如在血浆或组织样本中，预先去除白蛋白、免疫球蛋白等高丰度干扰蛋白。

 

3、数据分析策略

（1）采用Proteome Discoverer + SEQUEST/Byonic + SPS-MS3数据整合模块；

（2）使用Precursor Coisolation Threshold功能评估干扰程度；

（3）结合Reporter Ion S/N比过滤低质量肽段，提高数据质量。

 

四、SPS-MS3技术的适用场景

1、复杂组织样本的深度定量分析：如肿瘤组织、脑组织等高复杂度样本；

2、低丰度蛋白研究：如转录因子、细胞因子等低表达蛋白的筛选；

3、临床样本标志物发现：对定量精度要求极高的多组学临床研究；

4、药物作用机制研究：解析药物处理前后蛋白调控动态变化。

 

TMT技术作为高通量蛋白质组学的利器，唯有解决比值压缩问题，才能真正发挥其多通量定量的潜力。SPS-MS3为科研人员提供了稳定可靠的解决方案，特别适合高复杂度、微弱差异表达等场景。百泰派克生物科技致力于为您的每一个实验数据保驾护航。如果您正在进行TMT定量实验或遇到比值压缩问题，欢迎联系我们的专家团队，我们将为您提供一对一的技术支持与解决方案。

 

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