单细胞测序原理及应用
- 从细胞群中分离单个细胞；
- 提取、处理和扩增每个分离细胞的遗传物质；
- 制备分离细胞遗传物质的“测序文库”；
- 使用下一代测序仪对文库进行测序。
- 荧光激活细胞分选（FACS）—涉及用附着在靶标特异性抗体上的荧光分子标记细胞选择所依据的细胞蛋白质。细胞内的标记物可以通过细胞通透性来获取。因此，该技术允许根据多个参数来选择细胞。然而，FACS 需要至少10,000个起始细胞，并且快速流动可能会损害细胞的活力。
- 磁激活细胞分选（MACS）—使用抗体介导的超顺磁性纳米粒子来标记靶细胞上的特定蛋白质。这意味着，MACS与FACS不同，只有细胞表面分子可以用作标记活细胞的靶标。然后使用外部磁场来隔离标记的细胞，而其他的则被冲走。 因此，MACS分离的纯度取决于用于标记的抗体的特异性和亲和力。
- 激光捕获显微切割（LCM）—使用激光从放置在显微镜载玻片上的实体组织样本中分离靶细胞。这种分离可以通过两种方式进行：当红外光将激光能量转移到仅特异性结合靶细胞的不耐热聚合物上时，直接分离；当紫外线烧蚀细胞时，间接分离。与FACS和MACS 不同，LCM可用于完整组织。它也是快速和可靠的。然而，LCM需要通过目测其形态来识别靶细胞。此外，细胞在分离过程中可能会被切片，紫外线可能会损坏DNA和RNA分子。
- 人工细胞采集或显微操作—需要倒置显微镜并结合微量移液器来选择和分离靶细胞。显微操作已被用于活培养物和胚胎细胞分离。然而，它的吞吐量是有限的，并且与 LCM 一样，该技术需要熟练的专业人员才能正确识别目标细胞。
对核酸分子（如DNA或RNA）进行测序，可以得到关于其核苷酸（腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤）顺序的信息，从而提供生命所需的遗传指令。测序技术的发展源于20世纪70年代沃尔特·菲耶斯、弗雷德里克·桑格和雷·吴的开创性工作。几十年来，最初用于对核酸进行测序的方法和技术经历了飞速发展：从读取单个RNA分子开始，到对整个生物体的基因组进行测序成为可能。第一个人类基因组草图于2001年在人类基因组计划中发布，并在两年后完成。
商业DNA测序仪于1990年代后期首次问世。它们被命名为第二代或下一代测序仪，以区别于第一代实验性测序仪，并允许对整个基因组进行测序。在接下来的二十年里，测序仪不断更新迭代，不同程度地优化了速度、准确度、测序深度和读取长度等参数。现在已经针对特定应用开发了多种测序方法。虽然相对较新，但最有趣的之一是单细胞测序。本文探讨了这项技术的工作原理以及其应用领域。
什么是单细胞测序？什么是单细胞RNA测序？
传统的二代测序（NGS）对象是细胞群的基因组，例如细胞培养物、组织、器官或整个生物体。它的输出是细胞群的“平均基因组”。然而，单细胞测序的对象来自细胞群的单个细胞的基因组。如今，传统的测序方法被称为批量测序，以将它们与单细胞技术区分开来。
单细胞测序技术目前可用于测量群体中每个细胞的基因组（scDNA-seq）、DNA甲基化组或转录组（scRNA-seq）。这项技术已被用于识别癌细胞中的新突变，探索胚胎发育过程中发生的渐进性表观基因组变异，并评估看似同质的细胞群如何表达特定基因。
单细胞测序的原理是什么？
所有单细胞测序技术都需要四个主要步骤：
细胞分离和基本样品处理
可以使用不同的方法分离细胞，选择哪种方法主要取决于样品的性质和细胞分离后所需的处理步骤。每种方法的性能取决于其效率（每单位时间可以分离多少细胞）、纯度（收集的目标细胞的比例）和回收率（收集的目标细胞占初始可用目标细胞总数的比例）。常用的方法如下所示：
在继续进行文库准备之前，需对细胞分离的质量进行评估，并通过成像评估细胞的活性。还可以评估RNA的完整性，这对于scRNA-seq分析尤其重要。然后裂解分离的细胞。分离和扩增感兴趣的遗传物质（DNA 或 RNA）以提供足够多的量用于后续检测，因为单个细胞通常只产生微量的DNA或RNA。即使是进行scRNA-seq分析，通过以上步骤最终获得的产物是单链DNA，如下一节所述。目前已经开发了许多方案来处理特定研究的要求和限制，例如少量可用细胞。
制备测序文库
扩增的DNA要测序，首先需要做成测序文库。测序文库是来自一个细胞群或在单细胞测序的情况下来自一个特定细胞的单链DNA片段的集合。扩增后，对DNA片段进行唯一的条形码识别以确定它们属于哪个起始细胞，并将特定的接头序列添加到 5'和 3'末端。此时，需要测序的DNA部分通常称为插入片段。条形码和适配器将插入片段的一端或两端封住。属于同一测序文库的所有DNA片段都使用相同的寡核苷酸序列进行条形码化。这允许在同一测序运行期间将不同文库的汇集一起测序。适配器依赖于平台，需要对片段进行测序。商业试剂盒可用于所有样品和文库制备步骤。为确保生成的库准确地再现原始细胞的状态，已经开发了几种质量控制方法。
测序
各种商业测序平台已经开发出多种略有不同的方法。这里，我们主要介绍合成方法测序，包括焦磷酸测序和可逆终止子测序。在测序之前，一个扩增步骤通常会产生多组DNA片段克隆（通常通过桥式扩增或乳液 PCR）。由于每组克隆在测序过程中都会发出相同的信号，因此产生的簇或孔信号足以进行检测。这种类型的测序通常在可能包含微孔的芯片内进行。接头和其他分子（如聚合酶）与芯片（或微孔底部）结合，并与连接到插入片段的接头相互作用。插入片段的测序需要多个复制步骤，由聚合酶和使用荧光标记的核苷酸执行。在每个循环中，加入单个荧光标记的核苷酸，如果被聚合酶结合，则会触发特定核苷酸的特征性发光。在下一个循环开始之前，所有碎片同时发出的光谱通过相机记录下来。随着每个核苷酸发出不同的光，测序仪会逐个循环地重建所有插入片段的序列。测序仪还会读取插入片段的标签，将每个测量值分配到相应的库中。
质子检测测序使用不同的合成测序方法。片段通常与珠子结合并扩增以覆盖每个珠子（类似于焦磷酸测序）。然而，当在测序过程中添加碱基时，它释放的不是荧光标记和特征光，而是释放单个质子，然后对该质子进行检测和记录。
另一种不太常见的测序方法是连接测序。这种方法使用DNA连接酶而不是DNA聚合酶，它附着荧光标记的短序列而不是核苷酸。在测序之前，通常使用乳液PCR化学扩增法扩增DNA片段。由于插入的每个核苷酸随后被测序两次，因此该测序方法的结果非常准确。然而，连接测序仅输出较短的读数，并且与回文序列不兼容。
单细胞测序的类型
单细胞测序技术可以测量单个细胞的不同类型的遗传物质—基因组、转录组或甲基化组。以下介绍了这三种测序方法样品制备的差异以及其应用。
单细胞基因组测序
通过确定单个细胞的基因组，ScDNA-seq可以研究细胞群的基因组异质性。因此，它主要用于研究微生物组和癌症。微生物组是单细胞生物的群落，进行ScDNA-seq测序无需先分离和培养它们。测序数据可用于研究微生物组的组成，从而研究其生态学、进化和变化。在癌症研究中，ScDNA-seq用于研究肿瘤内遗传异质性或识别新的致癌突变。ScDNA-seq显著推动了精准医疗的发展。
对于ScDNA-seq，从分离细胞中提取的DNA最常使用的扩增方法是多重置换扩增 (MDA)、多重退火和环化扩增循环（MALBAC）。MDA可快速扩增微量DNA，基因组覆盖率良好但不均匀。MALBAC基因组覆盖较MDA差，但更均匀，因此更适合检测拷贝数变异。如前所述，文库是从扩增的DNA中产生的。要想让这种方法成功，一个均匀而有效的扩增是至关重要的。然而，没有一种扩增方法是完美的。特别是检测单核苷酸多态性（SNP）和拷贝数变异通常是非常低效的。因此，人们开发了不同的扩增方法来改进对特定突变类型的检测。
单细胞转录组测序（单细胞RNA测序，单细胞RNA-seq或scRNA seq）
ScRNA-seq对给定样本中每个细胞内的RNA分子进行测序。这一信息提供了细胞收获时转录组（正在转录的基因）的快照。自发展以来，ScRNA-seq已经得到了广泛的应用。虽然基因表达的最终产物是一种蛋白质，但检测其信使RNA（mRNA）表明该基因处于启动状态，因此有可能随后被翻译和表达。此外，共转录的基因可以用来推断构成特定细胞表型的基因调控网络。细胞群体的转录差异有助于识别亚群，例如肿瘤的恶性细胞。ScRNA-seq还用于研究重要的基因转录特征，例如剪接模式和单等位基因转录。由于细菌细胞中mRNA拷贝数低和 RNA不稳定性等因素，原核生物ScRNA-seq还存在挑战。当然，这些问题也在慢慢被克服。
分离的细胞被裂解，它们的mRNA分子是多腺苷酸化的，使用poly[T]引物进行富集。这个步骤非常关键，因为细胞中的大多数RNA分子是核糖体（rRNA）：它们非常大，而且通常不是转录组测序的目标。接下来，逆转录酶将poly[T]引发的单链mRNA转化为互补DNA （cDNA）。然后使用PCR或体外转录（IVT）来扩增cDNA分子。最后，将条形码标签和测序平台所需的其他短序列添加到cDNA分子中。
该技术的测序质量受几个因素的影响，主要是可以从细胞群中获得的文库总数和检测到的读数。理想的细胞数量取决于不同细胞亚群或状态的预期数量。读取的次数表明转录组被测序的深度，这取决于基因组的大小：读取深度越高，提供的细节越可靠。样品和文库制备也会影响结果的质量。
单细胞 DNA 甲基化组测序
DNA甲基化涉及将甲基转移到胞嘧啶碳上（通常是C5）。甲基化是一种表观遗传机制，可以改变DNA的活性而不影响其序列：在启动子中，DNA甲基化通常会抑制基因的转录。因此，单细胞DNA甲基化组测序（ScDNA-Met-seq）可用于研究基因相同的细胞群内的表观遗传变化，从而产生不同的表型。DNA甲基化对细胞特性至关重要，也是X染色体失活、基因组印记、转座原元件抑制、衰老和致癌的关键。这项技术主要用于发育研究，但也被用于探索罕见和极其活跃的肿瘤细胞亚群。
ScDNA-Met-seq的样品和文库制备与ScDNA-seq相似，但增加了一个步骤。即在扩增之前，将DNA进行亚硫酸氢盐转化，仅将未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶残基不受影响。然而，亚硫酸氢盐处理往往会导致DNA片段化和降解。虽然现已开发了其他方法，如甲基化敏感的限制性内切酶，但其仍无法用于单细胞测序。
单细胞测序数据分析
测序仪的最终原始输出首先在测序仪内直接处理，返回二进制碱基调用 (BCL) 文件和质量分数。BCL文件是二进制格式的原始测序输出。为了进一步分析，BCL文件随后被转换为FASTQ文件，这是一个包含序列信息和质量分数的文本文件。该步骤通常是在使用条形码标签对不同库的数据进行解复用于Linux服务器上进行。
可以对FASTQ文件进行处理，将序列与模板基因组进行比对，对其进行注释，检测变体，进行差异转录分析并将数据可视化。有一些第三方学术机构开发的脚本可用于执行这些初步分析。考虑到 FASTQ数据文件的大小（通常每个10-200 GB），这些分析中的大多数计算成本很高，因此通常使用其命令行在Linux服务器上执行。可以使用数据分析和统计工具进一步研究所得的数据，例如数据归一化、主成分分析、t分布随机邻域嵌入分析、聚类分析和通路或基因集富集分析。这些工具在探索大型数据集时很有帮助，因为它们可以识别出意想不到的模式和生物学行为，以及最显着驱动特定表型的基因或转录本。尤其是Bioconductor —为R统计编程语言开发的各种软件包，可为分析基因组数据提供免费的开源软件。该软件包中的工具旨在执行上述分析并可视化其结果。 某些工作流程和功能已针对单细胞测序分析进行了专门优化。
为什么单细胞测序很重要？
组织或器官中的每个细胞以不同的方式影响整个生物体的生理或病理方面。借助单细胞技术，我们可以探测每个细胞并研究其对整个细胞群及其生物体或生态系统的特定影响。在研究稀有细胞或探索相同细胞类型群体中的表型变异时，这种独特的技术特别有价值。例如，ScRNA-seq已被用于研究罕见的抗原特异性T或B细胞，测量人类微生物组的组成和结构，研究耐药肿瘤亚群的起源和发展，发现植物组织中以前未知基因的功能，研究肿瘤的进展机制，并根据肿瘤内的细胞异质性进行预后预测。由于单细胞测序技术的独特性，这些以及更多的应用已经在各个领域成为可能。
将单细胞测序与其他技术和单细胞技术相结合
现在经常结合各种全息技术来研究单细胞的多层次状态。通过结合前面描述的测序技术，可以研究同一细胞群内的基因组、表观基因组和转录组。批量测序技术和单细胞测序技术也经常与蛋白质组学方法相结合，包括代谢组学、磷酸化蛋白组学、乙酰化组学和糖蛋白组学。结合不同的单细胞组学方法可以更深入地了解细胞群的异质性，如识别更多的亚群，因为其他技术可能会发现不同类型的变异。也有可能推断出一种组学技术观察到的变化与另一种组学技术观察到的变化之间的联系。这些信息可以帮助确定新的因果关系，从而确定一个已知表型背后的机制。
目前也已经开发了一些计算方法来整合不同的全息影像数据集，包括创新的、基于机器学习的方法。然而，整合多组学单细胞数据的算法往往仍不充分。虽然文库制备方案和测序技术已经大大完善，但数据分析工具却仍然落后，这可能是目前该领域面临的最大挑战。
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