磷酸化蛋白质组学方法

蛋白质组是对生物体中所有蛋白质的序列鉴定和含量分析，但翻译后修饰（PTM）的信息也不容忽视。磷酸化蛋白质约占生物体所有蛋白质的1/3，因此磷酸化已成为最受关注的蛋白质PTM类型之一。

磷酸化蛋白的常用鉴定方法

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原理：SDS-PAGE凝胶电泳分离的蛋白质从PAGE凝胶转移到固相载体上，以一抗为探针，与标记的二抗结合，然后用显色剂显色。根据抗原抗体结合的特异性，只有磷酸化的蛋白才会在相应的分子量处出现一条带。

优点：特异性强，分辨率高，但只能半定量，现在多用于验证质谱结果。

缺点：难以识别新的位点，难以检测蛋白质的多个磷酸化位点，因为难以制备特异性磷酸化抗体。

同位素标记法

原理：以放射性同位素³²P标记的磷酸盐为磷酸基团供体，将³²P标记的磷酸盐基团在激酶催化下转移到底物蛋白上，然后进行凝胶电泳分离，并用放射性自显影法检测磷酸化蛋白。

优点：可检测蛋白磷酸化位点和单个蛋白磷酸化。

缺点：放射性强，危险。

质谱法

原理：质谱仪可以将被分析的样品电离成带电离子。这些离子在电场或磁场的作用下在空间或时间上分离。检测后，得到质荷比（m/z）和质谱的相对强度。为了计算分析物中分子的质量，可以利用质谱图对被分析物质进行定性分析，并根据离子强度进行定量分析。由于磷酸化多肽的分子量会增加79.9663 Da，因此可以从其他碎片离子信号中推断出序列水平的磷酸化修饰位点。

优点：高通量，可同时获得数千种蛋白质的定性和定量信息，可测定同一蛋白质的多个磷酸化修饰位点和水平。

缺点：技术难度高，需依赖专业的平台并具有丰富的质谱知识。

磷酸化蛋白质鉴定方法

磷酸化蛋白质“自下而上”质谱工作流程：

由于蛋白质磷酸化是一个动态过程，细胞内低水平的低丰度磷酸化蛋白质不容易检测到，高水平的磷酸化肽不仅抑制磷酸化肽电离，还会掩盖磷酸化肽信号。因此，在进行质谱分析之前，有效富集纯化的磷酸化蛋白变得至关重要。

磷酸化蛋白富集法

考虑到富集能力和成本，应用最广泛的包括固定化金属离子亲和层析（IMAC）和二氧化钛亲和层析（TiO₂）法。

IMAC原理：IMAC主要由三部分组成：金属离子、螯合剂和基质载体。在酸性条件下，固定相上的螯合剂与金属离子形成配位化合物，将金属离子固定在其上。带正电荷的金属离子与带负电荷的磷酸基结合，吸附磷酸化的肽段。

TiO₂原理：在金属氧化物亲和层析(MOAC)中，TiO₂是一种富集能力很强的金属氧化物。虽然TiO₂亲和层析和IMAC亲和层新都是基于金属离子与磷酸化多肽之间的静电相互作用来纯化和富集磷酸化蛋白。但由于TiO₂亲和层析金属原子与氧原子的相互作用力强，且较稳定，金属原子不易失去，因此得到广泛应用。

磷酸化蛋白定量方法

富集的磷酸化肽通过色谱法分离，并可通过质谱法检测。常用的质谱定量方法包括TMT、LFQ和DIA。

TMT定量

TMT是一种加入同位素标记的定量技术，可以同时对16个样品进行高精度标记和分析。除了鉴定整个蛋白质组外，TMT还可以用于磷酸化蛋白（PP）的研究。但是，每种标记试剂最多可标记100ug的肽。为了达到理想的富集效率，一般建议蛋白磷酸化修饰富集的起始量不低于1mg，如果采用TMT标记定量方法，建议样本数至少为10 。因此，TMT标记定量方法对样本量要求高，成本较高，而非标记定量更适合大规模检测。

FLQ

与TMT标记定量相比，非标记定量操作更简单，样品损失更少，一次实验可以定量更多的蛋白质，但严重依赖质谱仪的稳定性。传统的无标记定量方法是LFQ（Label-free），它依赖于DDA的数据采集方式，而磷酸肽异构体很难用DDA进行采样和分配。对大量样本中的磷酸化位点进行系统且可重复的分析具有挑战性。

DIA

DIA采集模式可以用于分析磷酸肽吗？

由于DIA数据采集窗口更宽，光谱更复杂，因此在混合光谱中正确定位磷酸化位点并正确分析磷酸肽异构体的能力需要更高水平的光谱处理。

2020年2月，来自丹麦的研究团队突破了这一技术难关，在《Nature Communications》上发表文章，提出了DIA和direct DIA（没有DDA文库构建的DIA）鉴定磷酸化蛋白的完整工作流程。研究团队通过TiO₂富集野生型酵母细胞中的磷酸化肽，然后分别通过DDA和DIA和dDIA对其进行量化。发现优化的DIA方法可量化多达DDA两倍的磷酸化肽，并且dDIA比DDA鉴定的重现性更好。将酵母磷酸肽与HeLa细胞磷酸肽样品按不同比例混合，然后分别进行定量。结果表明，DIA和dDIA定量的肽段也随着浓度的增加成比例增加，准确度更好。DIA 和 DDA 的错误率相当，但 DIA 在位点覆盖、灵敏度和动态范围方面优于 DDA。

总结

如果预算充足，样本量小，可以使用TMT检测磷酸化蛋白，否则推荐使用DIA方法，尤其是在样本量大的情况下，DIA在重现性和准确性上优于LFQ。

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