凝胶内或溶液中蛋白质消化简介
在用于蛋白质消化的内切酶中，丝氨酸蛋白酶-胰蛋白酶是最常见的一种，因为它生成的肽非常适合MS（/MS）分析。根据前面的工作流程，蛋白质的酶解消化是在凝胶中或在溶液中进行的。用于双向电泳的蛋白质通常采用凝胶内消化，而用于LC-MS/MS分析的蛋白通常采用溶液内消化。在消化过程中，蛋白质被酶切成有限数量的较短片段或多肽，以便根据蛋白质的特征质量和模式来识别蛋白质。
凝胶内消化
通过1-D或2-D凝胶电泳分离样品后，使用 MS 兼容染色剂（通常是考马斯蓝或采用无戊二醛方案的银）对蛋白质进行固定和可视化。从凝胶中切下可视化的蛋白质，并在胰蛋白酶消化之前洗涤相应的凝胶条带或斑点以进行脱色和脱水。
据信，通过用乙腈对凝胶进行脱水，随后在含有蛋白酶的消化缓冲液中溶胀，有助于蛋白酶向凝胶的渗透。不同的研究表明，蛋白酶渗透凝胶的过程几乎完全是由扩散驱动的。通过将凝胶切成尽可能小的碎片，可以提高凝胶内消化的效率。
表面活性剂（去污剂）有利于凝胶中蛋白质的溶解和变性，从而缩短消化时间，增加蛋白质的裂解和提取多肽的数量，特别是对于膜蛋白等亲脂蛋白质。通常在酸性条件下，可裂解去污剂会在消化后裂解。这使得洗涤剂的添加需与质谱法兼容。
为了确保凝胶基质中的蛋白质有效水解，通常使用相对较高浓度的酶。随后可以使用提取缓冲液（例如50%乙腈/5%甲酸）结合超声波，从凝胶基质中释放所生成的蛋白水解肽。为了满足具有不同物理和化学性质的肽的要求，可以使用碱性或酸性溶液进行迭代提取。
凝胶内消化和提取多肽的效率取决于各种因素，包括(i)：蛋白质及其产物的物理化学性质（如疏水性程度、大小、氨基酸序列）；(ii)凝胶的成分、大小和厚度； (iii)提取缓冲液的成分（例如乙腈浓度）；(iv)酶的类型及其比活性；(v)一般反应条件（如温度、时间、酶与底物的比例）；(vi)蛋白质染色的类型（如考马斯或银染）。
进行凝胶内蛋白质消化的一个显著优点是，任何污染物（例如洗涤剂、盐）在电泳过程中都已被去除，因此所产生的多肽样品可以容易地进行（LC/）ESI-MS分析。然而，由于蛋白酶对蛋白质的可及性差和/或肽从凝胶基质中释放效率低，该方法的有效性可能会受到限制。溶液内消化蛋白质是凝胶内消化的一种很好的替代方法，随后通常进行一维或二维液相色谱，以在ESI-MS之前有效分离所得的肽混合物。
溶液中消化
对于溶液中的消化，蛋白质溶解和酶活性非常重要。在蛋白质的潜在半胱氨酸或半胱氨酸的还原和烷基化（R&A）过程中，蛋白二硫键发生不可逆的断裂，导致其三级结构舒展开来。这种化学修饰允许具有大量二硫键的蛋白质以最大的水解程度和肽段覆盖率被成功鉴定。对于变性电泳法，强烈建议在进行电泳法之前进行反应，因为凝胶中含有能够修饰半胱氨酸的游离丙烯酰胺单体。
通常应避免使用去污剂。但是根据蛋白水解物的物理化学特性，可以使用有机溶剂和/或离液剂。对于难于溶解或变性的蛋白质（如膜蛋白）的分析，可使用8M尿素和弹性蛋白酶Lys-C；随后，在较低浓度的离液剂（2M尿素）下进行胰蛋白酶分解。在使用FA酸化之后，可以直接进行LC/ESI-MS，尽管通常建议在酸化后增加除盐步骤。作为尿素双重蛋白水解消化的一种替代方法，有机溶剂可用于溶解和有效消化溶液中的疏水性蛋白质。
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