生物制品表征之自由巯基定量
巯基和二硫键在生物化学和分子生物学中扮演重要角色，它们常以活性功能基的形式参与酶催化、辅助因子结合以及蛋白质构象的维持。研究巯基的数量和性质是获取特定结构信息的重要手段之一。
巯基定量常用的方法之一是利用Ellman法检测自由巯基浓度。该方法的原理是将DTNB试剂与游离巯基发生反应，生成2-硝基-5-硫代苯甲酸（TNB-）。在中性或碱性pH条件下，TNB-可以进一步离子化形成二价阴离子TNB2-。该TNB2-离子呈现黄色，在412nm波长处可见光吸收，因此可以定量测定TNB2-的浓度。通过使用半胱氨酸标准品或基于摩尔吸光系数的方法，可以对自由巯基进行定量分析。
北京百泰派克生物科技BTP基于该方法建立了自由巯基含量检测平台，获得CNAS实验室认可，可以准确测定样品中的自由巯基含量，为巯基相关研究提供有力支持。BTP可提供全面的解决方案，包括方法学的建立、验证以及后续样品检测。
一、自由巯基定量的方法及原理：
1. 使用半胱氨酸标准品进行定量
该方法通过将不同浓度的半胱氨酸标准品和待测样品与DTNB试剂反应，然后测定在412nm处的吸光值。通过使用半胱氨酸标准品的吸光值绘制标准曲线，将待测样品的吸光值代入标准曲线中，就可以得到自由巯基的浓度。
2. 基于摩尔吸光系数的定量
该方法基于一个基本原理，即添加1摩尔的巯基会释放1摩尔的TNB。通过测定在412nm处的可见光吸光度，可以定量测定TNB2-的浓度。由于在不同缓冲液中消光系数不同，可以使用以下公式计算样品中自由巯基的浓度：消光系数 = 吸光度 / （比色皿宽度（cm） * 摩尔浓度（mol/L））。
表1 在不同缓冲液中的消光系数
以上两种方法都可以准确测定样品中的自由巯基含量，根据实际需求选择适合的方法进行分析。
二、实验仪器
紫外-可见分光光度计
三、应用
自由巯基的含量与某些蛋白质的性质和存在方式密切相关，影响抗体的生物学功能。通过检测自由巯基的含量，可以在工艺早期对细胞系进行筛选，在蛋白质结构研究中具有重要意义。自由巯基含量的检测有助于了解蛋白质的构象和特性，进而为蛋白质工程和生物制药等领域的研究和应用提供重要参考。
四、案例示意
如图为标准曲线，横坐标为吸光度，纵坐标为半胱氨酸标准品浓度
五、方法验证
《中华人民共和国药典》2020年版三部通则0401/四部通则 0401紫外-可见分光光度计法根据检测方法验证表要求：
• 专属性确认：选用不同浓度（分别为1.50、1.25、1.00、0.75、0.50、0.25 mM）的半胱氨酸标准品，同时制备1.50、1.25、1.00、0.75、0.50、0.25 mM六种浓度供试品（不含半胱氨酸的多肽溶液），判断无关基团对检测是否有影响。
• 重复性确认：在1.0 mg/mL的供试品中分别加入终浓度为1.00 、0.75、0.50 mM的半胱氨酸标准品，每个浓度做六个重复，分别记录其吸光度，计算RSD。
• 线性确认：选用不同浓度（分别为1.50、1.25、1.00、0.75、0.50、0.25、0.00 mM）的半胱氨酸标准品溶液，进行五次重复性的实验，以半胱氨酸浓度Y对吸光值X作图来绘制标准曲线，计算最佳线性范围内的相关系数R2。
• 准确度确认：以1.0 mg/mL的供试品作为空白对照，对1.0 mg/mL的供试品分别制备0.5、0.75、1.0 mM三个浓度的加样回收样品进行回收率测定。
• 范围确认：将0.25 mM和1.5 mM 半胱氨酸作为待测样品进行检测，分别平行检测11次，计算变异系数（CV）。
常见问题
问题1：影响Ellman法测定自由巯基的因素有哪些？
回答：
1. EDTA用量：适量加入EDTA有助于稳定TNB的显色产物，以及确保测定结果与半胱氨酸的浓度成梯度线性关系。
2. 缓冲液：不同缓冲液对TNB的最大吸收波长略有差异，因此需根据所选缓冲液来确定合适的测定条件。
3. pH值：DTNB的降解速度随着pH的升高而加快，因此需在适当的pH范围内进行测定。
4. 温度：摩尔吸光系数在不同温度下有所变化，随着温度的升高，摩尔吸光系数可能会下降。
问题2：Ellman法测定自由巯基的优势是什么？
回答：Ellman法具有高灵敏度、操作简便、耗时短等优势。通过测定412nm处的吸光度，可以快速、准确地定量自由巯基的含量。此方法广泛应用于巯基含量的检测，并且在生物化学、分子生物学等领域中被广泛使用。
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