生物制品表征之LC-MS/MS肽段覆盖率分析

肽段覆盖率分析在生物制品质量控制和分析中扮演重要角色。肽段覆盖率是指蛋白质氨基酸序列和理论序列的一致性匹配程度，主要是针对蛋白一级序列的确认。该信息可以帮助研究者快速了解蛋白质的结构，对于判定蛋白药物的表达是否正确，批次与批次之间是否稳定具有重要意义。

百泰派克生物科技BTP应用现有的质谱技术平台，结合Nano-LC纳升色谱技术，提供以液相色谱串联质谱LC-MS/MS为基础的肽段覆盖率检测分析，保证了低丰度肽段碎裂片段鉴定的灵敏度，同时在肽段碎裂过程中采取HCD与ETD结合的模式，保证肽段碎裂片段的完整性。

蛋白质液质联用（LC-MS/MS）的肽段覆盖率分析技术服务

首先对样本进行前处理，即根据蛋白理论氨基酸序列结合质谱级别蛋白酶酶切位点信息使用特定蛋白酶对蛋白进行酶切，提高酶切效率，以便获得更高的覆盖度。实际实验中可以从多种蛋白酶（Trypsin、Chymotrypsin、Asp-N、Glu-C、Lys-C和Lys-N）中选择合适的蛋白酶对靶蛋白进行酶切。酶切之后的肽段混合物使用液质联用LC-MS/MS 高分辨率质谱平台分析。得到总离子流色谱图和质谱原始数据后，通过专业分析软件对采集到的质谱原始数据进行分析，匹配基于蛋白理论氨基酸序列建立的本地数据库实现肽段的鉴定并计算出肽段覆盖率。

一般流程

1、根据蛋白理论氨基酸序列使用特定蛋白酶酶切得到肽段混合物。

2、使用 LC-MS/MS 液质联用高分辨质谱平台对肽段混合物进行分析。

3、通过数据分析软件将得到的质谱原始数据与理论序列数据库进行比对分析。

4、肽段鉴定和肽段覆盖率计算。

应用

肽段覆盖率可以用于确认蛋白的表达是否正确，用于对蛋白质一级结构的确认，通过比较供试品和参比的异同，进行批间一致性分析，实现对药物表征结果的快速准确评估。

实验仪器:

• 液相色谱仪（Vanquish Neo UHPLC）

• 超高分辨率质谱仪（Orbitrap Fusion Lumos Tribrid With ETD）

结果展示

总离子流色谱图（Total Ion Chromatography，TIC）：将每个时间点质谱图中所有离子的强度加和后连续描绘得到的图谱，图中包含了离子强度和各组分在色谱中的保留时间（RT）。

肽段序列覆盖度：使用专业技术软件Biophama Finder进行肽段覆盖率的表征，更加清晰并可视化的表现出肽段序列覆盖度，有利于帮助客户更直观的获得结果信息。

常见问题

问题1：做肽段覆盖度时，对样品有什么要求呢？

回答：对样品纯度没有太高的要求，但是从原则上讲，样品纯度越高，同样上样量的前提下，肽段覆盖率越高；需要的靶蛋白样品量：10-20μg即可。

问题2：如何能得到更高的肽段覆盖度？

回答：在尽量保证蛋白纯度的前提下，样品前处理时，根据蛋白理论氨基酸序列结合质谱级别蛋白酶酶切位点信息使用特定蛋白酶对蛋白进行酶切，尽量选择酶切位点分布均匀的蛋白酶酶切，提高酶切效率，保证酶切之后的肽段混合物长度适宜离子化，以便获得更高的覆盖度。