单细胞蛋白分析：样本制备标准流程与注意事项

随着单细胞组学的快速发展，单细胞蛋白质组学（Single-Cell Proteomics, SCP）逐步从方法验证迈向规模化应用阶段，成为揭示细胞功能状态、群体异质性和微环境相互作用的核心技术之一。SCP直接从功能层面探测细胞状态，其研究价值在肿瘤、免疫、干细胞和神经科学等领域日益凸显。但SCP实验的技术门槛极高，尤其在样本制备这一环节，每一步操作都直接影响蛋白的回收率、酶解效率和最终质谱数据的质量。

 

一、单细胞蛋白分析样本制备标准流程

单细胞蛋白分析的制备流程包括五个主要阶段：单细胞分选、细胞裂解、蛋白酶解、肽段纯化/标记、上样与质谱检测。每一阶段需高度规范、避免误差累积。

1、单细胞分选（Single-Cell Isolation）

目的是从混合样本中分离出目标单细胞，确保每个反应体系中只有一个完整的活细胞。常用技术包括：

• FACS（荧光激活细胞分选）：利用表面标志物实现高纯度分选，适合多通道标记筛选。

• 微流控芯片：适合自动化、高通量实验，操作环境封闭，污染风险低。

• 稀释法或显微操控：操作灵活，适合特殊细胞，但通量有限。

 

2、细胞裂解与蛋白提取（Lysis & Extraction）

使用质谱兼容的缓冲液（如不含SDS的缓冲液），在低体积反应环境中裂解细胞，释放蛋白质。裂解方式可选择：

• 热裂解：高温破膜，简洁有效。

• 化学裂解：使用温和去污剂辅助裂解。

• 微量机械裂解：配合超声或冷冻-解冻。

 

3、蛋白还原、烷基化与酶解（Reduction, Alkylation & Digestion）

• 还原剂（如TCEP/DTT）断开二硫键；

• 烷基化剂（如IAA/CAA）封闭巯基，防止重组；

• 加入胰蛋白酶（Trypsin）或Lys-C，在37°C条件下完成长时间酶解（通常6–16小时）。

推荐使用如nanoPOTS、SP3法等自动化微反应体系。

 

4、肽段纯化与标记（Peptide Cleanup & Labeling）

• 采用C18磁珠、StageTip或微柱进行脱盐，去除酶解缓冲液中的杂质。

• 根据实验设计可进行TMT/iTRAQ等标签标记，实现多样本并行检测与定量。

 

5、上样与质谱分析（LC-MS/MS Injection）

• 使用纳升液相色谱（nanoLC）系统与高灵敏度质谱仪（如Orbitrap、timsTOF SCP）；

• 采集模式可选DDA、DIA、BoxCar-MS等，提升低丰度肽段识别能力；

• 低体积、高分辨率分析，实现单细胞分辨率的蛋白质定量。

 

二、样本制备过程中的关键注意事项

即使遵循标准流程，若忽视以下细节，也极易导致蛋白损失、数据偏差甚至实验失败：

1、污染控制与背景干扰

• 全程使用无酶、无蛋白耗材，如低吸附管（LoBind管）、无蛋白移液枪头；

• 操作环境应为洁净区或层流台，减少空气中蛋白、酶等污染源；

• 设置“空白孔”作为背景对照，识别环境噪声信号。

 

2、蛋白丢失与吸附问题

样本体积越小，越容易因吸附而造成蛋白/肽段损失。建议使用亲水处理的微孔板、硅化处理管壁，降低吸附；可使用磁珠（SP3）策略提高蛋白和肽段的回收率。

 

3、酶解效率与反应条件

• 控制pH在7.5–8.5，确保胰蛋白酶在最适条件下工作；

• 精准控制温度与反应时间，酶解不足或过度均会影响数据；

• 推荐设置反应内标准，监控酶解一致性。

 

4、批次效应与通量控制

• 多个单细胞样本之间应同时处理，避免批次差异；

• 引入TMT-bridge或“载体通道”策略做跨批次标准化；

• 样本编号与位置应记录清晰，避免信息混淆。

 

5、低丰度蛋白识别与数据缺失

• 使用DIA/BoxCar采集策略增加低丰度蛋白识别率；

• 数据分析中应用缺失值填补、强度归一化等算法（如MaxLFQ、DART-ID）；

• 选择合适质谱参数与搜索库，避免过度过滤导致信息丢失。

 

单细胞蛋白分析是构建“功能组学图谱”的关键手段，而样本制备正是其数据质量的第一道门槛。通过标准化流程与严格细节控制，可以有效提高蛋白识别覆盖率、增强实验可重复性，并为后续多组学整合分析打下坚实基础。作为专注于高通量组学技术的科研服务提供者，百泰派克生物科技始终紧跟单细胞蛋白质组学技术前沿，致力于为科研人员提供可靠、专业的单细胞蛋白质组学分析服务。我们期待与您携手挖掘微观世界的蛋白奥秘，共同拓展生命科学研究的边界。

 

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