如何选择合适的泛素化蛋白质富集策略？

泛素化（ubiquitination）作为一种关键的可逆蛋白质翻译后修饰，在细胞周期调控、蛋白质降解、DNA 损伤修复、信号转导等多条生命活动路径中发挥核心作用。研究泛素化的深度与精度，往往依赖高效且选择性强的富集策略。不同的实验目标、样本来源和研究深度，对富集方法的要求大相径庭。如何选择合适的泛素化蛋白质富集策略？这是科研人员在实验设计阶段必须解决的重要问题。合理的策略选择不仅关系到数据质量，更直接影响研究的效率与结论的可信度。

 

一、富集策略总览

1、通用抗泛素抗体法（Anti‑Ub Antibody Enrichment）

（1）原理与流程：通过泛素单抗（如 FK2、VU-1 或 P4D1）捕获泛素修饰蛋白，适用于泛素化蛋白全蛋白级别富集。

（2）优势：

① 通用性强，可覆盖多种泛素链类型

② 操作简便，与大多数实验室常规流程兼容

（3）局限：

① 抗体识别多泛素链类型，缺乏链型特异性

② 可能捕获大量非目标蛋白，导致质谱背景复杂

（4）应用场景：适合泛素化蛋白总量测定、泛泛搜索、筛选候选蛋白。

 

2、TUBEs（Tandem Ubiquitin Binding Entities）

（1）原理与流程：利用二价或更多泛素结合域串联提高对泛素链的亲和力，通常可捕获 K48、K63 链型。

（2）优势：

① 高亲和力，极大提升捕获效率

② 可富集特定泛素链型（如 K48 或 K63）

（3）局限：

① 结构相对复杂，价格偏高

② 需明确链型需求，不宜通用

（4）应用场景：适用于聚泛素链研究，如蛋白降解机制、信号转导路径。

 

3、修饰位点级别方法（K-ε-GG Remnant Enrichment）

（1）原理与流程：细胞裂解物经胰蛋白酶消化后，泛素残留 Gly–Gly（K-ε-GG）修饰的肽段捕获。使用专门对特定残基识别的抗体，直接富集泛素化位点。

（2）优势：

① 精准定位泛素修饰位点

② 下游质谱搜索简化，信噪比高

（3）局限：

① 仅通用于胰蛋白酶

② 对泛素链顶端肽段或小肽缺乏覆盖

③ 实验耗时、抗体成本偏高

（4）应用场景：适合泛素位点组学、定量比较、修饰位点精确研究。

 

4、流式多肽捕获（DiGly + TMT 或 TMTpro）

（1）原理与流程：在 K-ε-GG 富集基础上，结合TMT/TMTpro同位素标记进行多样本高通量对比。

（2）优势：

① 可在一个质谱实验中检测数十个样本

② 数据量大、定量精准

（3）局限：

① TMT标签昂贵，要求实验设计复杂

② 需高分辨质谱仪支持，如 Orbitrap Fusion Lumos

（4）应用场景：适合泛素组动态变化研究、药物干预、时间梯度实验。

 

二、影响选择的关键参数

1、研究目标：蛋白 vs 位点

（1）若只需识别泛素修饰蛋白名单 → 推荐抗泛素抗体法或 TUBEs

（2）若需精准定位泛素修饰位点 → K-ε-GG 富集是最优选择

 

2、泛素链型聚合结构

（1）K48 聚泛素链：蛋白质生物降解

（2）K63 链：信号传导、DNA 修复

TUBEs 可按链型选择，可有效富集目标链型蛋白。

 

3、定量需求与样本数

（1）对比组少（如 2~4 组）：推荐标签自由方法 + K-ε-GG 抗体（LFQ）

（2）多组（5 组以上）：推荐 TMT/TMTpro + K-ε-GG + 高通量 LC-MS/MS

 

4、样本类型与起始量

（1）细胞系/小动物组织（≤1 mg 蛋白）：TUBEs 或抗体法足矣

（2）大组织体积（≥10 mg 蛋白）：位点级别富集避免非特异捕获，建议 K-ε-GG 方法

 

5、实验室资源与预算

（1）抗体法与 TUBEs 基本工具费用不高（抗体成本占主）

（2）K-ε-GG 抗体 + TMT 材料成本高，但直接获取高质量位点数据，长远效果明显

（3）百泰派克可提供小批量试剂和定制试验方案，节省研发投入成本

 

三、性价比评价表

 



 

注：成本为典型实验估算，实际依赖于样本起始量、抗体/试剂品牌与实验规模。

 

四、实验流程一览（以 K-ε-GG 富集为例）

1、样本准备

（1）用 RIPA 或 SDS​​based buffer 迅速裂解

（2）蛋白定量，推荐使用 BCA/Bradford 方法

 

2、蛋白质消化

（1）流程：还原 → 烷基化 → 胰蛋白酶 4–16 h 温箱消化

（2）可选 二次酶消化（Lys​​C + Trypsin）改善覆盖度

 

3、预富集清理

（1）离子交换（SCX/SAX）或高 pH RP，分离干扰杂质

 

4、K-ε-GG 抗体富集

（1）冷链操作，4 °C 孵育 ≥1 h

（2）丢弃未结合物，洗脱后收集肽段

 

5、质谱分析

（1）纳升级 LC​​MS/MS，推荐使用高分辨仪如 Orbitrap Exploris/Fusion Lumos

（2）数据库搜索确保 FDR ≤ 1%（蛋白组 & 位点）

 

6、数据解析

（1）使用 MaxQuant、Proteome Discoverer + PTM​​Profiler、MSstats 等

（2）定量比较、GO 富集、泛素位点交互网络挖掘

 

五、选择合适的泛素化蛋白质富集策略原则：

1、明确研究目的：是蛋白层面还是位点层面？链型特异还是泛泛捕获？

2、评估成本预算与实验室资源：抗体法成本适中，SLiCE 可快速验证；TMT 适用于高通量多样本研究。

3、结合样本类型和起始量：小样本用高亲和 TUBEs，复杂样本推荐位点富集。

4、质量优先原则：若项目要求反复获得高覆盖/高准确度泛素位点数据，建议寻求专业平台（如百泰派克）协助。

 

若合理选择泛素化蛋白质富集方法，既能显著提高质谱覆盖率，也能帮助科研团队捕捉到关键泛素化位点。欢迎随时联系百泰派克。我们将结合您的项目背景，提供定制化实验设计并承担执行与数据解析，助力科研成果快速落地。

 

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