磷酸化定量蛋白质组学的核心原理和实验流程
磷酸化是最常见且功能最复杂的翻译后修饰之一，在细胞信号传导、代谢调控和疾病机制中扮演核心角色。磷酸化定量蛋白质组学（phosphoproteomics）的核心原理，是通过质谱技术结合特异性富集方法，系统性地识别和定量蛋白质的磷酸化修饰位点，从而解析信号通路的动态变化和分子机制。随着质谱技术和富集策略的快速发展，磷酸化定量蛋白质组学已成为系统性研究信号通路动态变化的强大工具。本文将深入解析磷酸化定量蛋白质组学的核心原理和实验流程，帮助科研人员系统理解其技术要点与应用前景。
一、磷酸化定量蛋白质组学定义
蛋白质磷酸化是一种可逆的翻译后修饰（PTM），主要发生在丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基上。它在调控信号通路、细胞周期、代谢调节等方面扮演核心角色。磷酸化蛋白质组学通过高分辨率质谱，对磷酸化位点进行大规模、定量检测和动态监测，是解析信号转导网络的“放大镜”。
二、磷酸化定量蛋白质组学核心原理
1、 特异性富集低丰度磷酸化肽段
由于磷酸化肽在复杂样本中的丰度极低，富集是实现高灵敏度检测的前提。常用策略包括：
① 金属氧化物亲和色谱（MOAC）：如TiO₂、ZrO₂选择性结合磷酸基团；
② 金属离子亲和层析（IMAC）：使用Fe³⁺或Ga³⁺离子富集带负电的磷酸肽；
③ 抗磷酸化抗体富集：特别适用于Tyr磷酸化位点的捕获。
2、 高分辨质谱分析与数据采集
利用Orbitrap、Q-TOF等高分辨质谱仪，结合**数据依赖采集（DDA）或数据独立采集（DIA）**技术，对磷酸肽进行精准的质量/电荷比（m/z）测量和定量。
3、 定量策略
① 标记法：如TMT/iTRAQ实现多样本同步定量；
② 无标记法（Label-Free）：基于峰面积积分或谱图计数实现相对定量；
③ SILAC：适用于细胞样本的稳定同位素代谢标记。
三、磷酸化定量蛋白质组学实验流程概览
1、 样本制备
① 细胞/组织裂解，提取总蛋白；
② 蛋白质定量与质量评估；
③ 胃蛋白酶（Trypsin）酶解为肽段。
2、 磷酸化肽段富集
① 采用TiO₂或Fe³⁺-IMAC进行选择性磷酸肽富集；
② 去除非特异性结合肽，优化洗脱条件提高特异性。
3、 质谱分析
① LC-MS/MS分析，获取高分辨谱图；
② 根据研究需求选择DDA或DIA模式；
③ 结合TMT或Label-Free方法进行定量。
4、 数据分析
① 使用MaxQuant、Spectronaut、Proteome Discoverer等软件进行肽段识别与定量；
② 磷酸化位点定位（Localisation Probability）；
③ 下游功能注释与通路富集（如KEGG、GO）分析。
四、磷酸化定量蛋白质组学应用前景与典型案例
1、肿瘤信号通路解析：识别关键激酶磷酸化活性，辅助靶点筛选；
2、药物作用机制研究：评估抑制剂对下游磷酸化事件的影响；
3、 时间序列分析：动态监控细胞响应过程中的磷酸化网络变化。
磷酸化定量蛋白质组学以其高通量、高灵敏度、定量化的优势，已成为探索生命活动本质的重要手段。在百泰派克生物科技，我们整合先进的Orbitrap Exploris 480质谱平台与自主优化的磷酸肽富集方案，可实现：高灵敏度检测低丰度磷酸化位点；精准定量多样本间磷酸化变化；支持复杂样本（如FFPE组织、临床液体活检）的高通量分析；提供从样本处理到生信分析的一站式服务。您将获得一站式、定制化的磷酸化组学解决方案，助力科研成果的快速产出与精准突破。
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